糖脂質による細胞表層シグナル伝達タンパク質の配向の制御

糖脂控制细胞表面信号蛋白的方向

基本信息

批准号：
09240235
负责人：
横山三紀
金额：
$ 0.96万
依托单位：
Nihon University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1997
资助国家：
日本
起止时间：
1997 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

1.MBP-CD38とガングリオシドとの共結晶の構造解析(1)界面活性剤非存在下でのMBP-CD38の大量調製本研究ではCD38とガングリオシドとの共結晶の構造解析を計画している。膜タンパク質であるCD38をそのまま大量に調製することは困難であることが予想されたので膜貫通部分を切り落とし、MBP-CD38(約66kDa)の大量調製を行った。大腸菌で発現させたMBP-CD38は不活性型であり、塩酸グアニジン存在下で透析することにより活性化が少量現れる。発現したMBP-CD38のS-S結合をDTT存在下で切断してから透析を行ったところ活性型の収率が上昇しまた界面活性剤非存在下での大量調製が可能になった。現在8Lの大腸菌培養液から約80mgのMBP-CD38が得られ、ゲル濾過カラムとFPLC MonoQカラムにより約1mgを活性型として得ている。(2)結晶下の条件検討MBP-CD38を直接濃縮すると、沈澱を生じて回収率が悪かった。そこでガングリオシド存在化で濃縮したところ回収率の低下が起こらなくなった。現在結晶化の条件検討を開始している。2.in vivoにおけるCD38とガングリオシドとの相互作用レチノイン酸処理をおこなうことによりHL60細胞の表面にCD38を発現させることができる(以下RA-HL60)。RA-HL60細胞の培地にガングリオシドを加えた場合にもNAD分解量の減少が見られた。阻害の程度は糖鎖構造に依存した。並行しておこなったFlow cytometryの実験では細胞表面のCD38量にはガングリオシド処理による変化がなかったのでガングリオシドはRA-HL60細胞の表面においてCD38と相互作用してそのNADase活性を阻害すると考えられる。

1.MBP-CD38和神经节苷脂共晶的结构分析 (1)在没有表面活性剂的情况下大规模制备MBP-CD38 在本研究中，我们计划分析CD38和神经节苷脂共晶的结构。由于预测直接制备大量作为膜蛋白的CD38是困难的，因此我们切断了跨膜部分并制备了大量的MBP-CD38（约66kDa）。大肠杆菌中表达的MBP-CD38无活性，在盐酸胍存在下透析时出现少量激活。当表达的MBP-CD38的S-S键在DTT存在下裂解，然后进行透析时，活性形式的产率增加，并且在不存在表面活性剂的情况下大规模制备成为可能。目前，从8L大肠杆菌培养物中获得了约80mg的MBP-CD38，并且使用凝胶过滤柱和FPLC MonoQ柱获得了约1mg的活性形式。 (2)结晶条件考察直接浓缩MBP-CD38时，出现沉淀，回收率较差。因此，当其在神经节苷脂存在下浓缩时，回收率没有发生下降。我们目前正在开始研究结晶条件。 2.体内CD38与神经节苷脂的相互作用通过视黄酸处理，可以在HL60细胞(以下称为RA-HL60)表面表达CD38。当将神经节苷脂添加到 RA-HL60 细胞的培养基中时，还观察到 NAD 降解量的减少。抑制程度取决于糖链结构。在平行流式细胞术实验中，神经节苷脂处理后细胞表面CD38的量没有变化，这表明神经节苷脂与RA-HL60细胞表面的CD38相互作用并抑制其NADase活性。