シロイヌナズナにおけるキネシン様モーター蛋白質遺伝子の構造と発現制御

拟南芥驱动蛋白样运动蛋白基因的结构及表达调控

• 批准号: 04257204
• 负责人: 高橋 秀夫
• 金额: $ 1.34万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1992
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1992 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-04257204/
• 关键词: モーター蛋白質; キネシン; シロイヌナズナ; 塩基配列; 二次構造予測; 遺伝子; モーター蛋白質; キネシン; シロイヌナズナ; 塩基配列; 二次構造予測; 遺伝子

動物細胞や下等真核細胞においては、ATPを利用し、微小管(マイクロチューブル)に沿って細胞内構造体の移送を行う動力蛋白質(モーター蛋白質)として、ダイニン(dyein)やキネシン(kinesin)が知られている。特にキネシン様蛋白質は、核分裂や種々の細胞内構造体の移送に関わる重要な機能を担っていることが次第に明らかになりつつある。本研究は、従来ほとんど研究の行われていない高等植物細胞におけるキネシン様微小管モーター蛋白質について、その存在を遺伝子レベルで明らかにするとともに、その構造・機能ならびに発現調節機講を解明しようとするものである。まず、キネシン重鎖ならびにキネシン様蛋白質に共通する、モーター・ドメインより、PCR用のプライマーを設計・合成し、シロイヌナズナのゲノムDNAを用いてDNA断片の増幅を行った。得られたPCR産物の塩基配列を調べた結果、少なくとも5つのキネシン様遺伝子(A〜E)が存在する可能性が示された。次にシロイヌナズナの葉、花などよりcDNAライブラリーを作成し、上記のA〜Eの断片をプローブとしてスクリーニングを行い、それぞれ複数のクローンを得た。これらのcDNAクローンの塩基配列の決定を行ったところいずれの領域からも、700アミノ酸以上の蛋白質をコードするORFが発見された。これらのORFから予想される蛋白質のアミノ酸配列は、いずれもC末端側に既知のキネシン様蛋白質のモーター・ドメイン領域と高い相同性を示した。一方、N末端側には小さな球状ドメインが中央部には大きなストーク構造を取り得るαへリックスに富む領域が認められた。そこで、これらの遺伝子をkat(kinesin related gene of Arabidopsis thaliana)と命名し、katA〜katEと呼ぶこととした。KatCのモーター・ドメイン領域部分を大腸菌を用いて発現・精製し、キネシン様の活性をもつことを確認した。

在动物细胞和较低的真核细胞中，染料蛋白和驱动蛋白被称为运动蛋白（运动蛋白），它们使用ATP沿微管运输细胞内结构。特别是，越来越清楚的是，风化蛋白样蛋白在各种细胞内结构的核分裂和运输中起重要作用。这项研究旨在阐明较高植物细胞中驱动蛋白样微管运动蛋白的存在，这些细胞过去尚未在基因水平上进行研究，并阐明其结构，功能和表达调节机制。首先，设计并从动力蛋白重链和驱动蛋白样蛋白的运动结构域设计并合成PCR的引物，并使用拟南芥基因组DNA扩增DNA片段。检查了所获得的PCR产物的核苷酸序列，并表明至少有五个驱动蛋白样基因（A-E）。接下来，使用拟南芥叶，花等创建一个cDNA库，并以探针筛选了a的片段，并获得了多个克隆。当确定这些cDNA克隆的碱基序列时，在所有区域都发现了编码700个氨基酸或更多氨基酸蛋白的ORF。这些ORF预测的所有蛋白氨基酸序列与C-末端的已知驱动蛋白样蛋白的运动结构域区域均显示出很高的同源性。另一方面，在N末端发现了一个小的球状结构域，并且在中央区域发现了一个可以采用大型Stoke结构的α-螺旋区域。因此，这些基因被命名为Kat（拟南芥的动力学相关基因），并将Kata称为Kate。使用大肠杆菌表达KATC的运动结构域区域并纯化，以确认其具有驱动蛋白样活性。