腎症超早期状態を反映する尿中エクソソームタンパク質の質的・量的変動解析

反映肾病早期阶段的尿外泌体蛋白的定性和定量变化分析

基本信息

批准号：
22H03531
负责人：
柴田貴広
金额：
$ 11.32万
依托单位：
Nagoya University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

项目摘要

2022年度は、尿中細胞外小胞に含まれるマーカー候補タンパク質の探索を行った。過食により肥満を伴って糖尿病を発症するとされるモデルラットOLETFおよびそのコントロールラットLETOについて、腎障害のマーカーである尿中アルブミン値の有意な上昇が認められない初期段階の尿を回収した。それぞれの尿サンプルから超遠心分離器を用いて細胞外小胞画分を得た。細胞外小胞マーカータンパク質であるCD9やAlixについて、ウェスタンブロットを行い、得られた細胞外小胞画分にこれらのタンパク質が存在することを確認した。また、粒子径測定の結果、100-200 nmの大きさであることを確認した。さらに電子顕微鏡観察により、脂質二重膜の小胞であることを確認した。これらの結果から、尿サンプルから細胞外小胞を回収できていることが確認された。得られたそれぞれのラット尿由来細胞外小胞よりタンパク質を抽出し、還元アルキル化後、トリプシン消化を行い、質量分析計に供し、OLETFラット尿由来細胞外小胞サンプルおよびLETOラット尿由来細胞外小胞サンプル間で変動のあるタンパク質を探索した。その結果、LETOラットサンプと比較してOLETFラット尿由来細胞外小胞サンプルにおいて有意に増加するタンパク質を見出した。この候補タンパク質について、特異的抗体を用いたウェスタンブロットによる評価を行ったところ、LETOラット尿由来細胞外小胞サンプと比較してOLETFラット尿由来細胞外小胞サンプルで有意に増加することを確認した。また、ウェスタンブロットにより、ラットの週齢が高くなっても両ラット間で有意な差があることが確認された。

在2022年，我们搜索了尿液中细胞外囊泡中包含的潜在标记蛋白。在模型的大鼠OLETF中，据说由于暴饮暴食而产生具有肥胖症的糖尿病及其对照大鼠Leto，在早期的尿液中，尿白蛋白水平没有显着增加，这些尿白蛋白水平没有显着增加，这些尿白蛋白水平是肾脏损伤的标志。使用超速离心的每个尿液样品从每个尿液样品中获得细胞外囊泡级分。在CD9和ALIX上进行蛋白质印迹，这些CD9和ALIX是细胞外囊泡标记蛋白，以确认这些蛋白存在于所得的细胞外囊泡分数中。此外，测量了粒径，并确认尺寸为100-200 nm。此外，电子显微镜证实它是脂质双层膜的囊泡。这些结果证实了细胞外囊泡可以从尿液样品中收集。从从大鼠尿液中获得的细胞外囊泡中提取蛋白质，并在还原烷基化后，进行胰蛋白酶消化，并经过质谱仪进行质谱仪，以搜索OLETF大鼠尿液尿液中尿液中尿的细胞外囊样品和liteo rine的尿液尿布尿液的尿液外卵形外细胞外的蛋白质。结果，与Leto大鼠样品相比，发现源自Oletf大鼠尿液的细胞外囊泡样品中蛋白质显着增加。使用特定的抗体通过蛋白质印迹评估了该候选蛋白，并确认与洛杉矶尿液尿液尿液尿液细胞外囊泡样品相比，OLETF大鼠尿液衍生的细胞外囊泡样品显着增加。蛋白质印迹证实，即使大鼠年龄较大，两只大鼠也存在显着差异。