腎症超早期状態を反映する尿中エクソソームタンパク質の質的・量的変動解析

反映肾病早期阶段的尿外泌体蛋白的定性和定量变化分析

基本信息

批准号：
22H03531
负责人：
柴田貴広
金额：
$ 11.32万
依托单位：
Nagoya University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

项目摘要

2022年度は、尿中細胞外小胞に含まれるマーカー候補タンパク質の探索を行った。過食により肥満を伴って糖尿病を発症するとされるモデルラットOLETFおよびそのコントロールラットLETOについて、腎障害のマーカーである尿中アルブミン値の有意な上昇が認められない初期段階の尿を回収した。それぞれの尿サンプルから超遠心分離器を用いて細胞外小胞画分を得た。細胞外小胞マーカータンパク質であるCD9やAlixについて、ウェスタンブロットを行い、得られた細胞外小胞画分にこれらのタンパク質が存在することを確認した。また、粒子径測定の結果、100-200 nmの大きさであることを確認した。さらに電子顕微鏡観察により、脂質二重膜の小胞であることを確認した。これらの結果から、尿サンプルから細胞外小胞を回収できていることが確認された。得られたそれぞれのラット尿由来細胞外小胞よりタンパク質を抽出し、還元アルキル化後、トリプシン消化を行い、質量分析計に供し、OLETFラット尿由来細胞外小胞サンプルおよびLETOラット尿由来細胞外小胞サンプル間で変動のあるタンパク質を探索した。その結果、LETOラットサンプと比較してOLETFラット尿由来細胞外小胞サンプルにおいて有意に増加するタンパク質を見出した。この候補タンパク質について、特異的抗体を用いたウェスタンブロットによる評価を行ったところ、LETOラット尿由来細胞外小胞サンプと比較してOLETFラット尿由来細胞外小胞サンプルで有意に増加することを確認した。また、ウェスタンブロットにより、ラットの週齢が高くなっても両ラット間で有意な差があることが確認された。

2022年，我们寻找尿液细胞外囊泡中含有的标记候选蛋白。据称，由于暴饮暴食而导致肥胖和糖尿病的模型大鼠 OLETF 及其对照大鼠 LETO 的尿液是在早期收集的，其中没有观察到尿白蛋白水平（肾损伤的标志物）显着增加。使用超速离心机从每个尿液样本中获得细胞外囊泡部分。对细胞外囊泡标记蛋白CD9和Alix进行Western印迹，确认了所得细胞外囊泡级分中存在这些蛋白质。另外，粒径测定的结果确认，粒径为100～200nm。此外，电子显微镜证实它们是脂质双层膜囊泡。这些结果证实可以从尿液样本中回收细胞外囊泡。从所获得的大鼠尿液来源的细胞外囊泡中提取蛋白质，进行还原烷基化、胰蛋白酶消化，并进行质谱分析，寻找囊泡样品之间存在差异的蛋白质。结果，我们发现与 LETO 大鼠样本相比，OLETF 大鼠尿液来源的细胞外囊泡样本中的蛋白质显着增加。当使用特异性抗体通过Western印迹评估该候选蛋白质时，证实与LETO大鼠尿液来源的细胞外囊泡样品相比，OLETF大鼠尿液来源的细胞外囊泡样品中该候选蛋白质显着增加。此外，蛋白质印迹证实，即使大鼠年龄较大，两只大鼠之间也存在显着差异。