細胞ダイバーシティーを基盤とした歯周組織幹細胞の運命決定機構の解明

基于细胞多样性阐明牙周组织干细胞命运决定机制

基本信息

批准号：
22H03269
负责人：
岩山智明
金额：
$ 11.15万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

项目摘要

本研究では歯根膜中の各細胞群のマスター転写因子や誘導因子を同定すると共に、歯根膜細胞特異的マウスを用いて細胞分化制御機構の解析を推進することにより、多様な細胞群の運命決定機構を解明することを目的としている。このために、①scATAC-seq法によるマスター転写因子探索、②歯根膜細胞特異的CreERマウスを用いた細胞系譜解析、③歯根膜細胞特異的CreERマウスを用いた歯根膜特異的遺伝子機能解析、④CRISPR-Cas9およびCRISPRa-SAMによる転写因子機能解析、の4つの解析を進める。初年度は主に以下の成果を得た。①これまでに開発した単離法を用いてマウス歯根膜由来細胞のscATAC-seqを実施した。scRNA-seq結果とほぼ同様のクラスタリング結果が得られ、セメント芽細胞のクラスターが同定された。さらに結合モチーフ解析により同クラスターに特徴的な転写因子が数個同定された。この転写因子群は骨芽細胞のクラスターのものとは異なっており、セメント芽細胞特異的な分化調節に関わる転写因子である可能性が示唆された。②歯根膜細胞特異的CreERマウスを用いて、長期的な恒常性維持および組織修復における歯根膜細胞の細胞系譜解析を行い、歯根膜細胞がセメント芽細胞や骨芽細胞、歯根膜線維芽細胞の系譜に直接分化することを明らかにした。③歯根膜特異的な古典的Wntシグナルの影響を検討するため、Ctnnb1遺伝子のfloxedマウスにPlap-1-CreERマウスを掛け合わせたマウスを作製し、組織学的な検討を行った。④これまでに樹立したマウス歯根膜細胞クローンを用いて、①で同定した転写因子について、CRISPR-Cas9によるノックアウト細胞を作製した上で、シングルセルソーティングによりサブクローンを樹立した。

这项研究旨在通过使用牙周韧带特异性小鼠促进细胞分化控制机制的分析来鉴定牙周韧带中每个细胞组的主要转录因子和诱导因子，并阐明各种细胞组的命运定位机制。为此，我们将进行四个分析：1）使用SCATAC-SEQ方法搜索主转录因子，2）使用牙周韧带特异性CREER小鼠分析细胞谱系分析，3）3）使用牙周韧带特异性细胞特异性驾驶员小鼠牙周韧带特定的基因功能分析，以及使用CRISPR-CAS-SAM的转录因子分析和4）转录因子功能分析。在第一年，我们主要实现了以下结果：1）使用先前开发的隔离方法在小鼠牙周韧带细胞上进行SSCATAC-SEQ。获得了与SCRNA-SEQ结果大致相似的聚类结果，并鉴定出胶质细胞簇。此外，通过结合基序分析确定了簇的几种转录因子的特征。这组转录因子与成骨细胞簇的因子不同，这表明它可能是与分化的胶质细胞特异性调节有关的转录因子。 ②使用牙周韧带特异性的CRER小鼠，我们在长期稳态维持和组织修复中对牙周韧带细胞进行了细胞谱系分析，揭示了牙周韧带细胞直接分化为胶质细胞，成骨细胞，成骨细胞和牙周韧带成纤维成纤维细胞。 ③为了研究特定于牙周韧带的经典Wnt信号的作用，制备了小鼠，其中将带有CTNNB1基因的小鼠乘以PLAP-1-creer小鼠，并进行了组织学检查。 ④使用到目前为止建立的小鼠牙周韧带细胞克隆，使用CRISPR-CAS9生成基因敲除细胞，用于①中确定的转录因子，并通过单细胞分类确定了亚克隆。