軟骨細胞分化の連続性を制御する階層的遺伝子発現ネットワークの解明

阐明控制软骨细胞分化连续性的分层基因表达网络

基本信息

批准号：
22H03254
负责人：
波多賢二
金额：
$ 10.9万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2026-03-31
项目状态：
未结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-22H03254/
关键词：
軟骨細胞エピジェネティクス

项目摘要

2022年度はシングルセルRNA-seqの解析と、シングルセルATAC-seqのデータ抽出を行った。まず、Col11-Enh-CreマウスとROSA26-CAG-LSL-ZsGreenマウスを交配し、軟骨細胞がZsGreenで標識されたCol11-Enh-ZsGreenマウスを作製した。全ての分化段階の成長板軟骨細胞が出現する胎生期15日目のCol11-Enh-ZsGreenマウスの四肢をコラゲナーゼ処理により1細胞レベルまで分離した後、セルソーターを用いてZsGreen陽性細胞、すなわち成長板軟骨細胞のみを回収し、10xChromiumシステムを用いてscRNA-seqを行った。次世代シークエンサーにより得られたデータを解析し、成長板軟骨細胞の全ての細胞のクラスタリングとその特異的遺伝子を抽出した結果、成長板軟骨細胞を従来の４段階ではなく、分化移行期を含む８つの細胞集団に分類し、それぞれのマーカー遺伝子を同定することに成功した。次に、同様のアプローチで胎生期15日目のCol11-Enh-ZsGreenマウスの四肢をコラゲナーゼ処理からセルソーターによる細胞回収を行ったのち、ジギトニン処理を４分間行うことで細胞核の抽出を行った。すべての細胞核をバルクでトランスポーズ処理した後、Chromium Controllerで10xバーコードがついたゲルビーズを加えてトランスポーズ処理したDNA断片を10xバーコードでラベルした。最終的に、次世代シークエンサーで解析を行いシングルセルATAC-seqデータとして抽出した。

在2022年，我们分析了单细胞RNA-seq并提取了单细胞ATAC-SEQ数据。首先，越过了COL11-ENH-CRE小鼠和ROSA26-CAG-LSL-ZSGREEN小鼠，并通过Zsgreen签署了带有软骨细胞的Col11-Enh-Zsgreen小鼠。生长板软骨细胞在所有分化的阶段，在胎儿时期的第15天，小鼠的四肢通过胶原酶加工分离为1个细胞水平，然后是Zsgreen阳性细胞，即仅收集和软骨。使用10xChromium系统进行SCRNA-SEQ。由于分析了通过下一个代序列获得的数据，并提取生长板软骨细胞中所有细胞的聚类及其特定基因，生长板软骨细胞不是常规的四个水平，而是分化过渡期成功地将它们分类为一个细胞组并识别每个标记基因。接下来，采用相同的方法，使用胶原酶处理的棒子在胎儿周期的第15天进行了COL11-ENH-ZSGREEN小鼠肢体，并通过进行吉吉托纳蛋白处理4分钟来提取细胞核。在所有细胞核中批量运输后，将带有10倍条形码在铬控制器中的10倍条形码的凝胶珠添加到带有10倍条形码的运输的DNA片段中。最终，通过下一代序列进行了分析，并提取为单个单元格seq数据。