細胞外小胞を介した胆道系恒常性システムとその異常による病態形成の解明

阐明细胞外囊泡介导的胆道稳态系统及其异常引起的发病机制

基本信息

批准号：
22H03052
负责人：
上野義之
金额：
$ 11.4万
依托单位：
Yamagata University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

项目摘要

① 肝細胞由来のEVと胆管上皮細胞由来のEVが異なるものであり、その極性にしたがって異なるEVを分泌することを明らかにする (R4年度よりR5年度前半予定)ダブルチャンバーシステムより、類洞側及び基底膜側に分泌されるEVを回収しデジタルPCR装置を用いて含まれる微量分子の同定を行った。用いる予定の不死化ヒト肝細胞及びヒト胆管上皮細胞について極性を持った培養法およびEVの分泌を確認した。さらに我々が開発したEVの分離法を用いてヒト胆汁サンプルを用いて実際のヒト胆汁中EVの構成分子の由来を検討し、正常状態と疾患状態における意義を検討した。ヒトサンプルの解析はデジタルPCR装置を用いた測定の他に、質量分析装置（LC-MS/MS）を用いたプロテオーム解析を行った。また胆管上皮細胞の類縁細胞である膵管上皮細胞からオルガノイドを作成する予備検討を研究室内で開始し、胆道構成細胞から作成する必要があった場合の基礎技術を応用する準備をした。② それぞれ下流の胆管上皮細胞に対して異なる細胞生物学的意味を持つか否かを明らかにする(R4年度後半～R5年度末予定)上記の方法で分離したEVを、培養ヒト及びマウス胆管上皮細胞の微絨毛を有する管腔側より添加し、細胞の変化を生理学的（胆汁分泌能、重炭酸濃度）、免疫学的（細胞内各種サイトカインmRNAの変化、管腔側培養上清中のビーズアレイアッセイ）、線維化能（MMPやコラーゲン産生能のmRNA測定、ELISA測定）から検討した。さらにEV添加された胆管上皮細胞から二次的に新たに放出されるEVを基底側腔及び管腔側よりそれぞれ回収し、２次的な細胞間クロストークについても保有している小腸上皮細胞株を用いて同様の検討、さらにプロテオーム（LC-MS/MS）解析を行なった。プロテオーム解析の基礎条件設定を開始し、基底膜側と類洞側でのプロファイルが異なることを見出した。

（1）源自从胆管上皮细胞衍生的肝细胞和电动汽车的电动汽车是不同的，很明显，它们根据其极性分泌不同的EV（计划在R4的上半部分，从财政R4中r4）双腔室系统。并回收了地下膜侧的EV，并进行了使用数字PCR设备的冰层多墨色。确认了使用不朽的人肝细胞和人类胆管上皮细胞的极性和电动汽车的分泌。此外，我们使用人类胆汁样品使用了我们开发的EV分离方法研究了实际人类胆电EV构型分子的起源，并检查了正常和疾病状况的重要性。除了使用数字PCR设备的测量值外，使用质量规格设备（LC-MS/MS）在纯ohm分析中对人类样品进行了分析。此外，在实验室中启动了从胰腺导管上皮细胞的胰腺细胞中产生类器官的初步研究，该细胞是胆管上皮细胞的胰腺细胞，并准备在胆汁组成细胞中创建基本技术时准备应用基本技术。（2）阐明与下游胆管上皮细胞（R4半r5年末期）EVs通过上述方法分开的EV是否具有不同的细胞生物学意义（R4细胞的一面，细胞的变化是生理的（胆汁分泌能力，胆汁碳酸化浓度），免疫学（细胞细胞因子mRNA的各种细胞，以及管侧的珠子，从阿里亚西西（Aleiassey）进行了检查），纤维化（MMP和MMP和MMP和胶原蛋白产生mRNA测量，ELISA测量）。此外，从EV增添的胆管上皮细胞中次要的EV是从基础和管侧回收的，并且还容纳了一个小的肠上皮细胞，该细胞也具有相似的次数横断面，并进一步分析了相似的检查。纯霍姆（LC-MS/MS）。我们开始设置strot ohm分析的基本条件，发现地下侧和洞穴侧的轮廓不同。