Elucidation of the universal aggravation mechanisms caused by emerging viruses focusing on small viral RNAs

阐明以小病毒RNA为重点的新兴病毒引起的普遍加重机制

基本信息

批准号：
22H02879
负责人：
渡邊洋平
金额：
$ 11.07万
依托单位：
Kyoto Prefectural University of Medicine
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2026-03-31
项目状态：
未结题

项目摘要

培養細胞を用いた感染実験により、新型コロナウイルス（SARS-CoV-2）は季節性コロナウイルス（HCoV-OC43及び229E）と同様に効率的にヒト細胞で増殖する一方ｄえ、SARS-CoV-2のみが感染後期にIFN産生を誘導する事象を見出した。ウイルス感染細胞から精製したRNA分画を細胞導入したところ、SARS-CoV-2感染細胞を由来とするsmall RNA分画のみがIFN誘導能を示したため、このRNAの同定を試みた。small viral RNA（svRNA）を効率的に解読するRNA-seq法を構築することで、HCoVと異なり、SARS-CoV-2がウイルスゲノムRNAの5’末端断片（5’ end svRNA）を大量に産生することが分かった。5’ end svRNAは、5’ triphosphateと末端63塩基によるRNA2次構造の存在によってRIG-Iを刺激していた。ヒト気道再構築モデルを用いたex vivo感染実験により、OC43と異なり、SARS-CoV-2が感染後期に5’ end svRNAを蓄積させてIFN応答を惹起することを明らかにした。また、SARS-CoV-2変異株間で5’ end svRNA産生量に相違があり、これは臨床的に報告されているウイルス病原性の違いと一致した。5’ end svRNAがウイルス複製に機能を持つのか評価するために、実験的な補完実験をおこなった。その結果、細胞内の5’ end svRNA量を100倍以上に増加させてもSARS-CoV-2 RNA複製量は変化しなかった。このことから、5’ end svRNAはウイルス複製自体を制御する役割はなく、異常なRNA複製の副産物として蓄積すると推察された。

使用培养细胞进行的感染实验表明，虽然新型冠状病毒（SARS-CoV-2）在人体细胞中的繁殖效率与季节性冠状病毒（HCoV-OC43 和 229E）一样，但我们发现只有 SARS-CoV-2 能够诱导 IFN 产生处于感染后期。当将从病毒感染细胞中纯化的RNA组分引入细胞时，只有来自SARS-CoV-2感染细胞的小RNA组分表现出IFN诱导能力，因此我们试图鉴定这种RNA。通过构建有效解码小病毒RNA（svRNA）的RNA-seq方法，我们发现与HCoV不同，SARS-CoV-2产生大量病毒基因组RNA的5'端片段（我发现5'端svRNA）。事实证明确实如此。由于由5'三磷酸和末端63个碱基组成的RNA二级结构的存在，5'端svRNA刺激RIG-I。使用人体气道重建模型进行的离体感染实验表明，与 OC43 不同，SARS-CoV-2 会积累 5' 端 svRNA，并在感染后期诱导 IFN 反应。此外，SARS-CoV-2变体之间产生的5'端svRNA的数量存在差异，这与临床报道的病毒致病性差异一致。为了评估5'端svRNA是否在病毒复制中具有功能，我们进行了实验性互补实验。结果，即使细胞中5'端svRNA的量增加100倍以上，SARS-CoV-2 RNA复制量也没有改变。由此推断，5'端svRNA本身并不发挥控制病毒复制的作用，而是作为异常RNA复制的副产物而积累。