RNA/RNP-chemogenetics for living cells and animals

活细胞和动物的 RNA/RNP 化学遗传学

基本信息

批准号：
22H02608
负责人：
吉井達之
金额：
$ 11.23万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-22H02608/
关键词：
化学遺伝学 RNA RNP 細胞タンパク質

项目摘要

2022年度は、RNA/RNP化学遺伝学を実現のため、低分子化合物に結合するRNAアプタマーの探索を行った。既存のアプタマーの殆どは哺乳類細胞内や動物個体内での動態が良くない低分子リガンドに対し結合するものであった。そのため、まず既に薬剤として生体内動態の良いことが明らかとなっているものに対して結合するRNAをin vitroでセレクションすることとした。10兆種類のRNA配列を含むライブラリを用いたSELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment) を行った。濃縮された配列に対し、次世代シーケンスにより解析を行い、候補配列を絞り込んだ。その配列に対し、試験管内での結合解析を行った。その結果、低分子化合物に結合するRNA配列を発見した。また、低分子化合物に結合したときにRNAへの親和性が向上するタンパク質の探索についても検討した。これには、タンパク質エンジニアリングとRNAエンジニアリングの両方からアプローチした。まずは、タンパク質とリガンドのペアが結合した時にのみ結合するような配列をSELEXにより選別した。得られた配列に対して試験管内で結合を評価した結果、低分子リガンドの添加時に標的タンパク質への親和性が向上することが明らかとなった。また、RNA結合タンパク質と低分子リガンドに結合するタンパク質を融合したライブラリを作製し、その中から、小分子リガンド結合状態でのみRNAに結合するタンパク質を探索した。得られた配列に対して試験管内で結合を評価した結果、低分子化合物存在下で標的タンパク質への親和性が向上することが明らかとなった。

2022年，我们寻找与低分子量化合物结合的RNA适体，以实现RNA/RNP化学遗传学。大多数现有的适体与低分子量配体结合，这些配体在哺乳动物细胞或动物个体中表现不佳。因此，我们首先选择了与已被证明具有良好体内动力学的药物结合的体外RNA。我们使用包含 10 万亿个 RNA 序列的文库进行了 SELEX（指数富集配体系统进化）。使用下一代测序分析富集的序列以缩小候选序列的范围。对序列进行体外结合分析。结果，他们发现了与低分子化合物结合的 RNA 序列。我们还研究了寻找与低分子量化合物结合时可增加 RNA 亲和力的蛋白质。我们从蛋白质工程和 RNA 工程两个方面来解决这个问题。首先，我们使用 SELEX 来选择仅在蛋白质-配体对结合时才结合的序列。对所获得的序列进行体外结合评价的结果表明，当添加低分子量配体时，与靶蛋白的亲和性提高。此外，我们创建了一个包含RNA结合蛋白和与小分子配体结合的蛋白质融合的文库，并搜索了仅在与小分子配体结合时才与RNA结合的蛋白质。对所获得的序列进行体外结合评价的结果表明，在低分子量化合物的存在下，与靶蛋白的亲和性得到改善。