Establishment of reconstituting method for G protein-coupled receptor into artificial membranes

G蛋白偶联受体人工膜重构方法的建立

基本信息

批准号：
22H02585
负责人：
林文夫
金额：
$ 11.32万
依托单位：
Kobe University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

项目摘要

人工膜研究は生体膜の構造や機能を理解する有力な手段てである。特に、ガラス基板に支持された脂質二層膜(Supported Lipid Bilayer: SLB) は高い安定性と多様な表面測定技術を活用できるという利点を持ち、センサーチップ開発などへの応用も期待できる。しかし、SLBに膜タンパク質をうまく組み込むのは依然困難な課題である。本研究計画では、「擬平衡ナノディスク」を使った新しいSLB形成法と、独自の「パターン化重合脂質二層膜技術」を融合させることによって、膜タンパク質のSLBへの効率的かつ高い配向性を持った組込方法を確立することを目的としている。光受容体ロドプシン (Rh)とそれに共役するGタンパク質トランスデューシン(Gt) を、医薬品標的の大半を占めるGタンパク質共役型受容体(GPCR)のモデル分子として採用している。初年度は、SLBへのRh組込み効率の向上と、配向性の高いRh組込み法を実現することが目的であったがいずれもほぼ達成できた。具体的には、N末の糖鎖やC末（Gt結合側）システイン残基に蛍光色素を付加したRhを調製し、いずれも可動性で、数10分子/μm2以上の組込に成功した。さらに、配向性の高いRh組込みには、Rhに光依存的にGtを結合させてRh*-Gt複合体を作り、これを脂質と共にナノディスクに入れSLBに展開した。ナノディスクがSLBとして伸展していく際にC末を上にするようにバイアスがかかるため、RhがおのずからC末を上に配向すると予想したものだ。また、この複合体は GTPによって解離するため、組み込まれた蛍光標識GtがGTP添加によって高速拡散すればRhがC末を上にして組み込まれていることが実証できる。これまでの実験で、GTPによるGtの高速化が認められ、我々が目的を達成する確度は格段に向上した。

人工膜研究是理解生物膜结构和功能的强大手段。特别是，在玻璃基板上支撑的支持的脂质双层（SLB）具有高度稳定和使用各种表面测量技术的能力，并有望应用于传感器芯片开发和其他应用。但是，将膜蛋白成功整合到SLB仍然是一个挑战性的挑战。该研究项目旨在通过使用伪平衡纳米刺激与独特的“图案化聚合脂质双层膜技术相结合，将膜蛋白的高效且高度定向的膜蛋白的整合方法与SLB建立。”将其偶联的感光动力蛋白（RH）和G蛋白转蛋白（GT）用作G蛋白偶联受体（GPCR）的模型分子，构成了大多数药物靶标。第一年的目的是提高RH整合到SLB中的效率并实现了高度定向的RH整合方法，但几乎所有这些都可以实现。具体而言，通过将荧光染料添加到N末端糖链和C末端（GT结合侧）半胱氨酸残基制备RH，并且都可以移动并成功地掺入了几十个分子/μm2或更多分子。此外，对于高度定向的RH整合，GT以光依赖性方式与RH结合，形成RH*-GT复合物，该复合物被放置在带有脂质的纳米虫中，并发展为SLB。随着纳米虫的扩展为SLB，C端子偏置以向上放置C端子，因此我们预测RH自然会向上向上定向C端子。此外，由于该复合物由GTP解离，因此可以证明，如果通过添加GTP迅速将荧光标记的GT迅速扩散，则将RH与C端向上合并。先前的实验表明，GTP已提高了GT速度，并且我们可以实现目标的可能性得到了显着提高。