病原細菌の網羅的検出を基盤とした小規模水供給システムにおける高度微生物リスク管理

基于病原菌综合检测的小型供水系统先进微生物风险管理

基本信息

批准号：
22H01626
负责人：
伊藤禎彦
金额：
$ 11.15万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

项目摘要

本年度は、(1)水源の病原細菌の一斉検出手法の整備、(2)小規模水供給施設の水源に関する実態調査、(3)一斉検出された病原細菌種の妥当性評価、を実行する計画であった。１については、16S rDNA全長(約1500 bp)を対象としたアンプリコンシーケンシング法によって水中の細菌群を網羅的に検出し、高い分類解像度で同定する手法の確立に取り組んだ。具体的には、ライブラリ調製時におけるPCRのアニーリング温度、伸長反応時間を変化させ、標準試料に含まれる細菌種を最もよく検出できるPCR条件を探索した。その後、塩基配列データの解析方法についても検討した。決定した手法を環境水に適用した結果、多くの細菌種を属レベルまでは検出・同定できた。しかし、病原種・非病原種の区別に必要な種レベルまでの分類結果はやや信頼性が疑われたため、シーケンシングエラーの問題を軽減しながら引き続き検討する必要性が生じている。一方、2については、京都府内の4箇所の小規模水供給施設を対象として調査を進めている。これまで月1回のペースで調査を重ねており、指標微生物(大腸菌、一般細菌、従属栄養細菌、嫌気性芽胞菌など)の測定データとDNA試料（上記１の病原細菌の一斉検出に使用予定）を蓄積している。また、これらの指標微生物濃度のみが利用可能な状況を想定した微生物リスク評価手法についても検討している。3については、1の分析手法に改善点が残ったため、まだ着手していない。次年度に一斉検出手法が確立してから、qPCR法や次世代シーケンサーMiseq（イルミナ社）によるデータ取得を行い、検出結果の妥当性を評価する予定である。

本财年，我们计划（1）开发同时检测水源中致病菌的方法，（2）调查小型供水设施的水源状况，以及（3）评估致病菌种类的有效性是同时检测到的。关于1，我们致力于建立一种方法来全面检测水中的细菌群，并使用针对16S rDNA全长（约1500 bp）的扩增子测序以高分类分辨率识别它们。具体来说，我们在文库制备过程中改变了 PCR 退火温度和延伸反应时间，以寻找最能检测标准样品中所含细菌种类的 PCR 条件。之后，我们还考虑了分析碱基序列数据的方法。通过将确定的方法应用于环境水，我们能够检测和识别许多细至属水平的细菌种类。然而，区分致病性和非致病性物种所必需的物种水平分类结果的可靠性有些值得怀疑，需要继续研究这一点，同时减少测序错误的问题。另一方面，关于2，我们正在以京都府内的四个小型供水设施为对象进行调查。到目前为止，我们每月进行一次调查，计划使用指示微生物（大肠杆菌、一般细菌、异养细菌、厌氧芽孢菌等）和DNA样本（用于检测）的测量数据。上述1）中提到的病原菌的同时检测已累积。我们还在考虑假设只能使用这些指示微生物浓度的情况的微生物风险评估方法。关于3，我们还没有开始，因为1的分析方法还有待改进的地方。明年建立同步检测方法后，我们计划使用qPCR和下一代测序仪Miseq（Illumina）获取数据，并评估检测结果的有效性。