STUDY ON RATIONAL DEVELOPMENT OF NOVEL ANTIBIOTICS TAGRETING DnaA DOMAIN IV

靶向DnaA结构域IV的新型抗生素的合理开发研究

• 批准号: 13558090
• 负责人: KATAYAMA Tsutomu
• 金额: $ 7.17万
• 依托单位: Kyushu University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 2003
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-13558090/
• 关键词: DNA replication; Cell cycle; DnaA protein; E.coli; DNA polymerase; AAAt motif; ATP; Antibiotics; DNA結合; NMR; X線結晶解析; AAA+ファミリー; 染色体複製制御

To establish rational process for developing novel antibiotics that targets DnaA protein, we analyzed structure-function relationship of the DNA-binding domain of DnaA, DnaA domain IV(DAD-IV). First, we overproduced and purified a truncated DnaA protein that contained only the DAD-IV. We found that DAD-IV sustains specific affinity for DNA and secondary structure by gel-retardation assay and CD analysis. Then we determined the secondary structure in solution of DAD-IV using NMR. Determined structure suggested that DAD-IV contained a three helices-bundled type helix-turn-helix motif. In addition, NMR analysis suggested that interaction sites of DAD-IV with DNA. Finally, we determined crystal structure of a complex of DAD-IV with DNA using X-ray diffraction analysis. Determined structure by this well coincided with the data obtained by NMR and by other biochemical and genetic analysis. Candidates of antibiotics were searched by the method of virtual screening, based on the structure of DAD-IV/DNA complex.

为了建立开发针对 DnaA 蛋白的新型抗生素的合理流程，我们分析了 DnaA 的 DNA 结合域、DnaA 域 IV（DAD-IV）的结构-功能关系。首先，我们过量生产并纯化了仅包含 DAD-IV 的截短 DnaA 蛋白。通过凝胶延迟测定和 CD 分析，我们发现 DAD-IV 对 DNA 和二级结构保持特异性亲和力。然后我们使用 NMR 测定了 DAD-IV 溶液中的二级结构。确定的结构表明DAD-IV含有三螺旋捆绑型螺旋-转角-螺旋基序。此外，NMR分析表明DAD-IV与DNA的相互作用位点。最后，我们使用 X 射线衍射分析确定了 DAD-IV 与 DNA 复合物的晶体结构。该孔测定的结构与NMR以及其他生化和遗传分析获得的数据一致。根据DAD-IV/DNA复合物的结构，采用虚拟筛选的方法寻找候选抗生素。

项目成果

Nishida, S., Fujimitsu, K., Sekimizu, K., Ohmura, T., Ueda, T., Katayama, T.: "A uncleotide switch in E. coil DnaA protein initiates the chromosomal replication : Evidence from a mutant DnaA protein defective in regulatory ATP hydrolysis and in vivo"Journ

Nishida, S.、Fujimitsu, K.、Sekimizu, K.、Ohmura, T.、Ueda, T.、Katayama, T.：“大肠杆菌 DnaA 蛋白中的叔核苷酸开关启动染色体复制：来自突变 DnaA 的证据

Su'etsugu, M., et al.: "Molecular mechanism of DNA replication-coupled inactivation of the initiator protein in Escherichia coli : Interaction of DnaA with the sliding clamp-loaded DNA and the sliding clamp-Hda complex"Genes to Cells. (in press). (2004)

Suetsugu, M. 等人：“大肠杆菌中起始蛋白 DNA 复制偶联失活的分子机制：DnaA 与滑动夹加载的 DNA 和滑动夹-Hda 复合物的相互作用”基因到细胞。

片山 勉(分担執筆): "ゲノムの複製とその制御(松影昭夫・正井久雄編)"シュプリンガーフェアラーク東京. 234 (2002)

Tsutomu Katayama（合著者）：“基因组复制及其控制（由 Akio Matsukage 和 Hisao Masai 编辑）”Springer Verlag Tokyo 234（2002）。

Katayama, T. et al.: "Replication system in the E.coli genome(Advances in Genomics and Proteomics(T.Imanaka(ed.))"N.T.S.. (2004)

Katayama, T. 等：“大肠杆菌基因组中的复制系统（基因组学和蛋白质组学进展（T.Imanaka（编辑））”N.T.S.（2004 年）

片山 勉, 他: "ゲノミクスとプロテオミクスの新展開〜生物情報の解析と応用〜"(株)エヌ・ティー・エス(印刷中). (2004)

Tsutomu Katayama 等人：“基因组学和蛋白质组学的新发展 - 生物信息的分析和应用”NTS Corporation（印刷中）。