p53ノックアウト霊長類ES/iPS細胞を利用した白血病幹細胞発生機構の解明

使用 p53 敲除灵长类 ES/iPS 细胞阐明白血病干细胞发育机制

基本信息

  • 批准号:
    26893187
  • 负责人:
  • 金额:
    $ 0.92万
  • 依托单位:
  • 依托单位国家:
    日本
  • 项目类别:
    Grant-in-Aid for Research Activity Start-up
  • 财政年份:
    2014
  • 资助国家:
    日本
  • 起止时间:
    2014-08-29 至 2015-03-31
  • 项目状态:
    已结题

项目摘要

白血病では少数の白血病幹細胞より白血病細胞が供給されていると考えられているが、白血病幹細胞の起源となる前白血病幹細胞が正常な造血幹・前駆細胞よりも効率よく増殖・自己複製する競合優位性を獲得するメカニズムは十分には明らかになっていない。本研究では代表的がん抑制遺伝子であり白血病のドライバー変異遺伝子でもあるTP53に着目し、その異常ががん遺伝子と組み合わさるときに造血幹・前駆細胞の競合優位性に与える影響について霊長類ES/iPS細胞由来の造血細胞を用いて解析する。初年度は、ゲノム編集技術を駆使してTP53欠損ヒトES細胞を樹立し、その品質評価を行った。TP53欠損ヒトES細胞はmRNA・タンパク質レベルでTP53を欠損していることをRT-PCR法とウェスタンブロット法で確認した。また、この細胞をマイトマイシンC存在下で12時間培養すると、正常対照細胞と比較して細胞死に至る割合が有意に減少していることをフローサイトメトリー解析により明らかにした。このことから、TP53欠損ヒトES細胞ではTP53依存性アポトーシスが起こっていないと推察され、機能面でも標的遺伝子の欠損が確認された。加えて、ヒトES細胞より胚様体形成法により誘導されるCD34陽性細胞が赤血球・骨髄球系細胞に加えてTリンパ球系への分化能をもつことを、ストローマ細胞OP9-DL1との共培養したCD34陽性細胞由来血液細胞のフローサイトメトリー解析により確認した。さらに、がん遺伝子(変異型RASなど)を強制発現させるレトロウイルスベクターを構築し、ウイルスを作成した。今後は、ES細胞由来CD34陽性細胞を用いてTP53欠損とがん遺伝子の発現が、その増殖・自己複製に与える影響について検討する。
在白血病中,白血病细胞被认为是由少数白血病干细胞提供的,但作为白血病干细胞的起源的白血病前期干细胞具有竞争优势,因为它们比正常造血细胞更有效地增殖和自我复制。干细胞和祖细胞的实现机制尚不完全清楚。在本研究中,我们以典型的抑癌基因和白血病驱动突变基因TP53为研究对象,探讨其异常与灵长类ES中的癌基因结合时对造血干细胞和祖细胞竞争优势的影响。使用源自 iPS 细胞的造血细胞。第一年,我们利用基因组编辑技术建立了TP53缺陷的人类ES细胞并评估了其质量。 RT-PCR和Western blotting证实TP53缺陷的人ES细胞在mRNA和蛋白水平上缺乏TP53。此外,流式细胞仪分析显示,当这些细胞在丝裂霉素C存在下培养12小时时,与正常对照细胞相比,细胞死亡率显着降低。由此推断,在TP53缺陷的人ES细胞中并未发生TP53依赖性细胞凋亡,并且在功能方面也证实了靶基因的缺陷。此外,我们与基质细胞OP9-DL1合作,证实了通过胚状体形成法衍生自人ES细胞的CD34阳性细胞除了红细胞和骨髓细胞之外还具有分化为T淋巴细胞的能力。通过流式细胞术分析培养的 CD34 阳性细胞来源的血细胞。此外,他们构建了一种逆转录病毒载体,强制表达癌基因(突变的RAS等)并创造了病毒。未来,我们将利用ES细胞衍生的CD34阳性细胞来研究TP53缺陷和癌基因表达对其增殖和自我更新的影响。

项目成果

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