新規抗体作製法を用いた抗血小板活性化因子受容体抗体の樹立

利用新的抗体生产方法建立抗血小板激活因子受体抗体

基本信息

批准号：
23890173
负责人：
平川城太朗
金额：
$ 1.08万
依托单位：
University of Shizuoka
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Research Activity Start-up
财政年份：
2011
资助国家：
日本
起止时间：
2011 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究計画は新規に提案する手法に従い、血小板活性化因子受容体(PAFR)に対する新規抗PAFRモノクローナル抗体を作製することを目的とする。PAFRはGタンパク質共役型受容体であり、これまでにウエスタンブロッティング法やフローサイトメトリー法などに使用可能なモノクローナル抗体は作製されていないのが現状である。そのため、PAFRを過剰に発現する細胞株でPAFR欠損マウスを免疫するという手法を用い、効率よく抗PAFRモノクローナル抗体の作製を目指した。まず始めに、マウスPAFR遺伝子ををpcDNA3、1に挿入後、シークエンスを確認しコンストラクトを作製した。免疫元となるPAFR過剰発現株の作製はチャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO-K1)、マウス胸腺腫(BW5147)にピペット型遺伝子導入装置を用いて遺伝子導入し、セレクション・クローニング後、リアルタイムPCR法により高いPAFR発現を持つクローンを確認し、PAFR過刺発現株を樹立した。続いてPAFR発現CHO-K1をアジュバントAlumと混合させ、2週間から1ヶ月おきに腹腔内投与を4回行った。細胞株免疫後にマウス血清を回収し、PAFR発現BW5147への血清反応性(抗体価)をフローサイトメトリー法にて解析すると僅かではあるが、免疫3回後から抗体価の上昇が確認された。以上の結果、新規に提案する手法を用いることにより、PAFRに対する免疫誘導がマウス生体内で起こることが確認された。複数のPAFR過剰発現株を用いることにより、マウスへの免疫、抗体スクリーニングまで、抗体捌立に有用な細胞株が樹立できたことが明らかとなった。

该研究计划的目的是根据新提出的方法生产一种新的抗PAFR单克隆抗体，用于血小板激活因子受体（PAFR）。 PAFR是一种基于G蛋白的受体，尚未在可用于蛋白质印迹方法和流动位点实现的单克隆抗体中产生。因此，我们旨在使用对PAFR缺乏的小鼠的免疫方法有效地创建抗PAFR单克隆抗体，其细胞量过多，该细胞量过多表达PAFR。首先，将小鼠PAFR基因插入PCDNA3和1中，并确认序列可以创建构建体。 Pafr过高的股票是PAFR的来源，以中国仓鼠卵巢（CHO-K1）和小鼠胸腺瘤（BW5147）的形式引入带有移液器型基因引言设备，以及选择克隆后，它是高的，它是高的，它是高的，它是高的，它是高的，它是高的。通过实时PCR方法，确认了具有PAFR表达的克隆，并建立了PAFR的股票。随后，将PAFR表达CHO-K1与隔离明矾混合，每两周至一个月进行四次腹部给药。当细胞库存免疫后收集小鼠血清，并通过流场Metry定律分析了与PAFR表达BW5147的血清反应（抗体价格）时，在三种免疫力后确认了抗体价格上涨。结果，已经证实，通过使用新提出的方法，对PAFR的免疫引导发生在小鼠体内。多个PAFR超过表达的菌株的使用表明，从免疫到小鼠和抗体筛选有用的细胞用于抗体处理。