迅速かつ簡便な組織特異的遺伝子ノックダウンマウス作成法の開発

开发一种快速简便的方法来创建组织特异性基因敲除小鼠

基本信息

批准号：
23890073
负责人：
大沢匡毅
金额：
$ 2.08万
依托单位：
Gifu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Research Activity Start-up
财政年份：
2011
资助国家：
日本
起止时间：
2011-08-24 至 2013-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-23890073/
关键词：
遺伝子改変マウスノックダウン色素細胞遺伝子機能解析

项目摘要

ポストゲノム時代の生命科学の喫緊な課題は、遺伝子の生理的機能を解明することである。ヒトの疾患の多くが遺伝的要因によって引き起こされることから、遺伝子の生理的機能がわかれば疾患の分子的メカニズムが解明され、新たな治療法の開発が可能になる。遺伝子の生理的な機能を明らかにする最も確実な方法は、遺伝子改変マウスを作成し、その表現型解析から遺伝子の機能を決定することである。しかし、従来の遺伝子操作技術は煩雑で多大な時間と労力を要し、問題である。本研究課題では、表現型解析が容易な色素細胞系をモデル系として用い、ES細胞を用いた遺伝子操作技術と胚操作技術を組み合わせることで、迅速かつ容易に色素細胞特異的遺伝子ノックダウンマウスを作成する技術を開発することを目標とする。このために、我々は、色素細胞特異的にCre相同組換え酵素を発現する取Tyr-CreトランスジェニックマウスよりES細胞を樹立するとともに、このES細胞のRosa26遺伝子座特異的にFRTカセットをノックインした安定株を樹立した。これにより、遺伝子ノックダウンコンストラクトを簡便に導入するとともに、Cre相同組み換えによる色素細胞特異的な安定的遺伝子ノックダウンが可能になった。また、樹立したES細胞を、ポリビニールアルコールで処理した8細胞胚にインジェクションすることにより、FO世代でフルキメラマウスを得る技術を確立した。本遺伝子ノックダウンマウス作成技術の有効性を評価する目的で、メラニン色素合成酵素であるTyrosinase遺伝子に対するノックダウンコンストラクトをES細胞に導入し、8細胞胚に移植することにより、マウスを作成した。誕生したマウスは、FO世代で体毛色を消失し、我々が開発した手法の有効性が確認された。本遺伝子操作マウス作成技術を用いることで、体毛色変化を指標にして、迅速に遺伝子機能解析を行うことが可能になった。

后基因组时代生命科学面临的紧迫挑战是阐明基因的生理功能。由于人类许多疾病都是由遗传因素引起的，了解基因的生理功能将有助于阐明疾病的分子机制，并为开发新的治疗方法提供可能。阐明基因生理功能最可靠的方法是创建转基因小鼠并通过表型分析确定基因的功能。然而，传统的基因操作技术复杂且需要大量的时间和精力，这是有问题的。在本研究项目中，我们将使用易于进行表型分析的色素细胞系作为模型系统，并通过将利用ES细胞的基因操作技术与胚胎操作技术相结合，快速、轻松地产生色素细胞特异性基因敲除目标是开发创造的技术。为此，我们从Tyr-Cre转基因小鼠中建立了在色素细胞中特异性表达Cre同源重组酶的ES细胞，并且还在这些ES细胞中的Rosa26位点特异性敲入了FRT盒，建立了稳定的储备。这使得能够通过 Cre 同源重组轻松引入基因敲低构建体和稳定的色素细胞特异性基因敲低。我们还建立了一种技术，通过将建立的 ES 细胞注射到用聚乙烯醇处理的 8 细胞胚胎中，获得 FO 代的完全嵌合小鼠。为了评估这种基因敲除小鼠创造技术的有效性，通过将酪氨酸酶基因（一种黑色素合成酶）的敲除构建体引入ES细胞并将其移植到8细胞胚胎中来创造小鼠。出生的小鼠在 FO 代中失去了体色，证实了我们开发的方法的有效性。通过使用这项技术创建基因工程小鼠，可以利用体毛颜色的变化作为指标来快速分析基因功能。