新規糖質加リン酸分解酵素を活用した機能性オリゴ糖のライブラリー化

使用新型碳水化合物磷酸酶创建功能性寡糖文库

基本信息

批准号：
23880010
负责人：
中井博之
金额：
$ 2.08万
依托单位：
Niigata University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Research Activity Start-up
财政年份：
2011
资助国家：
日本
起止时间：
2011-08-24 至 2013-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-23880010/
关键词：
酵素糖生理活性

项目摘要

生体内糖質代謝に関与する糖質加リン酸分解酵素(ホスホリラーゼ)による糖質合成収率は極めて高く、産業上有用な酵素になり得る。しかしながら、既知のホスホリラーゼは14種類のみと報告例が少なく、今後生産可能なオリゴ糖のバリエーション拡大には、新たなホスホリラーゼの発見が必須であった。本研究では様々な生物種のゲノム情報を活用して、これまでに報告例のない新規なホスホリラーゼを見出し、各種酵素の糖受容体特異性を明らかにすることで、新規オリゴ糖のライブラリー化を試みた。まず真正細菌由来のホスホリラーゼ様タンパク質(Cphy1874、Cphy1019)をコードする遺伝子をPCR法により単離し、大腸菌による異種宿主発現系を確立した。Cphy1874はリン酸存在下でグルコース2分子がα-1,3結合したニゲロースを加リン酸分解すること、さらにβ-グルコース1-リン酸(糖供与体)とグルコース(糖受容体)を出発材料とした際はニゲロースを高収率合成することが分かった。本結果により、Cphy1874はこれまでに報告例のない新規加リン酸分解酵素ニゲロースホスホリラーゼであることが明らかになった。Cphy1019については、リン酸存在下で既知のグルコ2糖に対して加リン酸分解活性を示さなかったが、糖質合成反応にてL-ラムノースを糖受容体とした際にのみ合成活性を示した。反応生成物の構造を核磁気共鳴分光法にて確認したところ、3-O-α-D-グルコシル-L-ラムノースであったことから、Cphy1019は新規加リン酸分解酵素3-O-α-D-グルコシル-L-ラムノースホスホリラーゼであることが判明した。今回得られた両新規酵素の詳細な糖受容体特異性を調査することで、これまでに6個の新規α-1,3グルコシルヘテロ2糖の合成に成功している。

碳水化合物的碳水化合物添加磷酸盐降解酶（磷酸化酶）的碳水化合物合成，体内涉及碳水化合物代谢，并且可以是一种工业有用的酶。但是，仅报告了14个已知的磷酸酶，很少有病例，并且为了扩大未来可以产生的寡糖变化，发现新的磷酸酶是必不可少的。在这项研究中，我们试图通过利用各种生物体的基因组信息，发现前所未有的新型磷酸化酶，并阐明各种酶的糖受体的特异性来创建新型的寡糖库。首先，通过PCR分离了编码磷酸化酶样蛋白（CPHY1874，CPHY1019）的基因，以使用大肠杆菌建立异源宿主表达系统。发现在磷酸盐存在下，尼日利糖的CPHY1874磷酸盐降解，α-1,3键的两个分子的葡萄糖分子，当β-葡萄糖1-磷酸（糖供体）和葡萄糖（糖受体）（糖受体）被用作起始材料时，发现Nigerose nigerose nigerose在高率中均可使用高产。这些结果表明，CPHY1874是一种新型的磷酸盐降解酶Nigerose磷酸化酶，从未报道过。 CPHY1019在存在磷酸盐的情况下对已知葡萄糖糖的磷酸盐降解活性并未表现出来，但仅当L-Rhamnose用作碳水化合物合成反应中的糖受体时，它才显示出合成活性。通过核磁共振光谱证实了反应产物的结构，发现CPHY1019是一种新型的磷酸盐降解酶3-O-O-α-D-α-D-d-葡萄糖基-L-RHAMNOSE磷酸化酶。通过研究这次获得的两种新型酶的详细糖受体特异性，我们已经成功合成了迄今为止六种新型α-1,3-葡萄糖基异含糖。