脂質酸化酵素のクロストークにより産生される新規生理活性脂質の探索

寻找由脂质氧化酶串扰产生的新型生物活性脂质

基本信息

批准号：
22K20570
负责人：
中島史恵
金额：
$ 1.83万
依托单位：
Nagoya University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Research Activity Start-up
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-08-31 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

標品5-OH-thromboxane B2の作製を行った。作製には一重項酸素付加反応を用い、thromboxane B2と光増感剤であるメチレンブルーを4℃にて一晩反応させた。サンプルをHPLCにより分析・精製した後、質量分析装置による解析を行った結果、 thromboxane B2の5位の炭素にOH基を有する5-OH-thromboxane B2の生成が確認された。さらに、精製した標品5-OH-thromboxane B2を用いて、質量分析装置による検出の最適化を行い、5-OH-thromboxane B2の定量方法を確立した。5-OH-thromboxane B2を検出するin vitroの系の確立を行った。5-OH-thromboxane B2の産生に必要な酵素である5-リポキシゲナーゼ、シクロオキシゲナーゼ-2、トロンボキサン合成酵素の3つの酵素の発現が期待されるヒト血液由来細胞であるHL-60を用いて検討を行った。DMSOを4日間処理し、成熟顆粒球へと分化させたのち、LPS刺激によりシクロオキシゲナーゼ-2の発現を誘導した結果、シクロオキシゲナーゼ-2により産生されるprostaglandin E2/D2、トロンボキサン合成酵素によって産生されるthromboxane B2の生成が確認された。また、カルシウムイオノフォア刺激により、5-リポキシゲナーゼにより産生されるleukotriene B4の生成が確認された。これらのことから、成熟顆粒球へと分化させたHL-60に適切な刺激を行うことで、5-OH-thromboxane B2の産生に必要な酵素である5-リポキシゲナーゼ、シクロオキシゲナーゼ-2、トロンボキサン合成酵素の三つの酵素を発現することが明らかとなり、成熟顆粒球へと分化させたHL-60がin vitroモデルとして使用可能であることを確認した。

制备5-OH-THROMBOXANE B2。使用单线氧添加反应进行制剂，并在4°C下过夜反应光敏剂B2和光敏剂甲基蓝。在通过HPLC分析和纯化样品后，使用质谱仪进行了分析，并确认了5-OH THROMBOXANE B2的形成，该组合在Thromboxane B2的位置5位于碳的OH基团。此外，使用质谱仪使用纯化的制备5-OH thromboxane B2优化检测，并建立了一种定量测定5-OH thromboxane B2的方法。建立了一个体外系统以检测5-OH thromboxane B2。该研究是使用HL-60（一种人类血液衍生细胞）进行的，该细胞有望表达三种酶，5-脂氧合酶，环氧合酶-2和势氧烷合酶，这对于生产5-OH thromboxane B2是必不可少的。在处理DMSO 4天后，分化为成熟的粒细胞，通过LPS刺激诱导环氧合酶-2的表达，并确认由cycloxygogygenase-2和Thromboxane B2产生的Prostaglandin E2/D2的产生证实了由血管烷合成酶产生的。此外，刺激离子载体证实了5-脂氧酶产生的白三烯B4的产生。从这些结果中可以揭示出通过适当刺激已与成熟的粒细胞区分为成熟的粒细胞的HL-60，它表达了三种酶，5-脂氧合酶，环氧酶-2和势酰羧酸合酶，这是5-OH-thromboxane B2和HL-60的酶，这些酶是所需的酶粒细胞可用作体外模型。