線維性異形成症における感受性遺伝子の探索とクリスパー技術を用いた骨分化機構の解明

利用CRISPR技术寻找纤维异常增生的易感基因并阐明骨分化机制

• 批准号: 21K21015
• 负责人: 安藤 和代
• 金额: $ 2万
• 依托单位: Hiroshima University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Research Activity Start-up
• 财政年份: 2021
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2021-08-30 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21K21015/
• 关键词: Cecr2; CRISPR/Cas9; hBMSCs; Fibrous dysplasia; RNA -seq; Chipーseq; 骨分化誘導; G タンパク共役型受容体; 間葉系幹細胞; GPCR

当初の予定では、CRISPR/Cas9 技術を用いて、hBMSCs のCecr2 遺伝子をノックアウトした細胞株（Cecr2 KO hBMSCs）を樹立。Cecr2 のWTとCecr 2 KO hBMSCs 細胞を用いて、骨分化誘導を行い、骨代謝マーカー (アルカリフォスファターゼ (ALP)、Bone Sialo protein (BSP) など) の発現レベルについて現有の定量PCRおよび定量Western blot解析を行い、さらに、ALP活性およびCa量の定量評価及びアリザリンレッド染色法を用いた石灰化能の検討を行い、さらに骨分化誘導後のCecr2 WTとKO hBMSCs 細胞を用いて、RNA-seq によって骨分化に関連する遺伝子の発現変動を網羅的な解析、また同条件下で、Cecr2 WTとKO hBMSCs のクロマチン免疫沈降シークエンス（ChIP-seq）を行い、その結果から、アセチル化された骨分化関連遺伝子のプロモーターあるいはエンハンサー領域において、どの部位に Cecr2 が結合しているか解析し、Cecr2 により制御される骨分化関連遺伝子の同定及び、Cecr2 KOがアセチル化領域全体の増減に影響するかも解析する予定であったが、産休育休取得のため、ノックアウト細胞株の作成まで行っている状況である。

原计划是利用CRISPR/Cas9技术建立hBMSCs Cecr2基因敲除的细胞系（Cecr2 KO hBMSCs）。使用Cecr2 WT和Cecr2 KO hBMSCs细胞诱导成骨分化，并利用现有的定量PCR和定量Western blot分析分析骨代谢标志物（碱性磷酸酶（ALP）、骨唾液酸蛋白（BSP）等）的表达水平此外，我们定量评估了ALP活性和Ca含量，使用茜素红染色法检查了矿化能力，并进一步进行了成骨分化诱导后的Cecr2。我们利用WT和KO hBMSCs细胞，通过RNA-seq综合分析了骨分化相关基因的表达变化，并根据结果对Cecr2 WT和KO hBMSCs进行了染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）。 ，我们分析了 Cecr2 在乙酰化成骨分化相关基因的启动子或增强子区域中结合的位点。我们原本计划鉴定Cecr2 KO调控的成骨分化相关基因，并分析Cecr2 KO是否影响整个乙酰化区域的增加或减少，但由于产假，我们目前正在创建敲除细胞系be。