ヒトiPS細胞由来肝細胞による肝不全に対する革新的治療法の開発・展開

使用人 iPS 细胞来源的肝细胞开发和部署肝衰竭的创新治疗方法

基本信息

批准号：
18H06245
负责人：
武石一樹
金额：
$ 1.91万
依托单位：
Kyushu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Research Activity Start-up
财政年份：
2018
资助国家：
日本
起止时间：
2018-08-24 至 2020-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-18H06245/
关键词：
iPS細胞肝不全人工肝臓人工臓器

项目摘要

患者本人の細胞から肝細胞を作成し、移植することができれば、肝移植におけるドナー不足や拒絶反応などの問題を解決でき、肝不全に対する革新的な治療法になり得る。iPS細胞は多分化能を持ち、肝不全に対する人工肝細胞のもとになる可能性があるが、現在までに臨床応用可能となったiPS細胞由来肝細胞は存在しない。今回の目的は、iPS細胞を分化させ、iPS由来肝細胞を作成し、その肝細胞も肝不全モデル動物に細胞移植することで、iPS由来肝細胞が肝不全に対して、生体内で治療効果を有するかどうかを明らかにすることである。まず、iPS細胞株の樹立を行うこととした。ヒト肝切除検体より線維芽細胞を取り出し、その線維芽細胞に山中遺伝子を導入することで、ヒトiPS細胞を3種類作成し、培養の定型化を行った。作成したiPS細胞が幹細胞の特徴を有することをNanog、OCT3/4の免疫染色およびqPCRにてその発現を評価することで、確認した。このヒトiPS細胞の多分化能を評価するため、3D培養をおこなうことで、外胚葉、中胚葉、内胚葉に分化する能力を持っていることを免疫染色にてそれぞれ確認した。つぎにiPS細胞の内胚葉への分化を行うために、内胚葉への導入を行った。Activin、BMP4、FDF2の濃度を振り分けて、4日間培養し、最も分化効率が良かった濃度を同定した。この導入効率を確認するために、内胚葉の分化マーカーである。SOX17の発現量を免疫組織化学染色、qPCRにて確認した。この内胚葉を肝芽細胞に分化するため、HGFにて刺激を行った。このHGFの至適濃度を確認するため、濃度を振り分けて実験を行った。肝芽細胞に分化させた細胞は、アルブミン、HNF4Aの発現を認めた。

如果能够利用患者自身细胞制造肝细胞并进行移植，就可以解决肝移植中供体短缺和排斥反应等问题，并可能成为肝衰竭的创新治疗方法。 iPS细胞具有多能性，可作为治疗肝衰竭的人工肝细胞的来源，但迄今为止，还没有可用于临床的iPS细胞来源的肝细胞。本研究的目的是分化iPS细胞，创建iPS衍生的肝细胞，并将这些肝细胞移植到肝衰竭模型动物体内。首先，我们决定建立 iPS 细胞系。通过从人肝切除标本中提取成纤维细胞并将山中基因导入成纤维细胞，我们创建了三种类型的人 iPS 细胞并将其培养标准化。我们通过使用 Nanog 和 OCT3/4 免疫染色和 qPCR 评估其表达，确认所创建的 iPS 细胞具有干细胞的特征。为了评估人类iPS细胞的多能性，我们进行了3D培养，并通过免疫染色证实它们具有分化为外胚层、中胚层和内胚层的能力。接下来，为了将iPS细胞分化为内胚层，将它们引入内胚层。我们将Activin、BMP4和FDF2的浓度分开，培养4天，并确定分化效率最高的浓度。为了确认这种引入的效率，使用内胚层分化标记。通过免疫组织化学染色和qPCR证实SOX17的表达水平。为了将该内胚层分化为成肝细胞，用 HGF 进行刺激。为了确定HGF的最佳浓度，我们进行了不同浓度的实验。发现分化为成肝细胞的细胞表达白蛋白和 HNF4A。