Development of the novel therapy for NAFLD by Engineering Fatty Liver from iPS cells

利用 iPS 细胞工程化脂肪肝开发治疗 NAFLD 的新疗法

基本信息

批准号：
21H03004
负责人：
武石一樹
金额：
$ 11.07万
依托单位：
Kyushu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21H03004/
关键词：
iPS細胞非アルコール性脂肪性肝炎肝硬変星細胞 PNPLA3 脂肪肝 NASH 人工肝臓 iPS 肝がん

项目摘要

iPS細胞よりPNPLA3遺伝子の野生型からCRISP技術を用いて、PNPLA3の遺伝子配列の1塩基配列を変え、変異株の作成に成功した。この変異株は、他の遺伝子配列については、全く同じ配列であることを確認しているので、この２つのiPS細胞の違いはこの1塩基配列のちがいから起こるものであると考えられる。iPS細胞を６日間、成長因子と培養することで、星細胞に分化させることに成功した。この作成した星細胞を免疫染色およびq PCRにて遺伝子発現を検討すると、星細胞のマーカーであるαSMAやCollagen１の発言を認め、野生株および変異株にてその発現では差を認めず、を作成した。野生株および変異株ともに星細胞へ分化させて、星細胞マーカーの発現を検討したところ、分化に差は認めなかった。分化後の二つの細胞をTGFにて刺激すると、変異株の星細胞が強く活性化し、増殖速度も速くなることがわかった。さらに、変異株はCollagen１の発現が高くなり、線維化マーカーの発現が高くなった。２つの細胞株をRNAシークエンスを行うと、変異株の星細胞において、肝線維化に関わる線維化マーカーや、炎症性サイトカインの発生に関わる遺伝子の発現が高くなることがわかった。変異株の星細胞にて、IL-6の遺伝子発現が高くなることがわかった。IL-6は炎症性サイトカインにて、星細胞での線維化に関わっていることがわかっており、変異株の培養液中のIL-6を測定すると、発現量が高くなっていることがわかった。以上より、変異株の星細胞は、野生株よりもより強く活性化し、線維化に関わる遺伝子群の発現が高く、IL-6の炎症性サイトカインが高くなることがわかった。

使用CRISP技术，PNPLA3基因序列的单碱基序列从IPS细胞更改为PNPLA3基因的野生类型，并成功创建了突变菌株。由于该突变体已被确认为其他基因序列的序列完全相同，因此认为这两个IPS细胞之间的差异是由于单基碱基序列的差异而发生的。通过培养具有生长因子6天的IPS细胞，我们成功地区分了星形胶质细胞。当通过免疫染色和Q PCR检查产生的恒星细胞的基因表达时，通过αSMA和胶原蛋白是星细胞的标记观察到星细胞的表达，在野生和突变菌株中的表达中没有观察到差异。当将野生和突变菌株分化为星形胶质细胞并检查星形胶质细胞标记的表达时，在分化中没有发现差异。发现在用TGF刺激分化后的两个细胞时，突变的星状细胞被强烈激活并增加了生长速率。此外，突变菌株增加了胶原蛋白1的表达和纤维化标记的表达增加。发现两种细胞系之间的RNA测序增加了参与肝纤维化的纤维化标志物的表达，以及与突变体星状细胞中炎性细胞因子发育有关的基因。发现突变体星形胶质细胞中IL-6的基因表达增加。已经发现，IL-6是一种炎症性细胞因子，参与星形胶质细胞的纤维化，当测量突变株培养基中的IL-6时，发现它具有较高的表达水平。从上面可以发现，突变的星状细胞比野生菌株更强烈地激活，并且涉及纤维化的基因的表达更高，并且IL-6的炎性细胞因子更高。