Analysis of activation mechanism of OPN4, a photoreceptor for circadian entrainment

昼夜节律光感受器 OPN4 激活机制分析

• 批准号: 18H06042
• 负责人: 木股 直規
• 金额: $ 1.91万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Research Activity Start-up
• 财政年份: 2018
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2018-08-24 至 2020-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-18H06042/
• 关键词: 光受容; OPN4

非視覚系の光応答を担う光受容分子OPN4の活性化メカニズムをアミノ酸残基レベルで解明するため、マウスOPN4の変異体解析を行っている。着目したアミノ酸残基がOPN4の光活性化メカニズムに重要であることを確かめるには、発現するOPN4分子数に対する細胞の光応答を測定する必要がある。そこで、細胞に発現した野生型と変異型OPN4の発現量を比較するため、C末端に蛍光タンパク質mCherryが結合したOPN4（OPN4-mCherry）を作製した。OPN4-mCherryを発現させた培養細胞の光応答を観測したところ、野生型OPN4を発現させたものと同様の光応答を示したことから、OPN4-mCherryを変異体解析のコントロールに使用できることがわかった。そこで、脊椎動物ロドプシンの光活性化に重要なアミノ酸残基であるY191およびY268に着目し、これらに相当するOPN4のアミノ酸残基(Y224およびY309)についての変異体(Y224FおよびY309F)を作製した。これらの変異体を培養細胞に遺伝子導入したところ、両変異体ともに発現が確認できた一方で、野生型を発現した細胞とは異なる光応答を示した。この結果から、Y224およびY309がOPN4の光活性化メカニズムに関わるアミノ酸残基であることを見出した。また、OPN4の光活性化メカニズムの生理的な意義を見出すため、アデノ随伴ウイルス（AAV）を用いてマウスの光感受性網膜神経節細胞（ipRGC）に変異体OPN4を発現させることを計画している。そのために、まずは感染した細胞で組み換え酵素Cre依存的に野生型OPN4-mCherryを発現させるAAVを作製した。その結果、マウスipRGCに感染させる上で十分な力価のAAVを得られた。

为了在氨基酸残基水平上阐明OPN4（一种负责非视觉光反应的光感受器分子）的激活机制，我们正在分析小鼠OPN4的突变体。为了确认感兴趣的氨基酸残基对于 OPN4 的光激活机制很重要，有必要测量细胞对表达的 OPN4 分子数量的光响应。因此，为了比较野生型和突变型 OPN4 在细胞中的表达水平，我们创建了 C 末端附着有荧光蛋白 mCherry 的 OPN4 (OPN4-mCherry)。当我们观察表达 OPN4-mCherry 的培养细胞的光响应时，我们发现光响应与表达野生型 OPN4 的细胞相似，表明 OPN4-mCherry 可以作为 Ta 突变体分析的对照。因此，我们关注脊椎动物视紫红质光激活的重要氨基酸残基Y191和Y268，并为OPN4的相应氨基酸残基（Y224和Y309）创建了突变体（Y224F和Y309F）。当将这些突变体引入培养细胞时，两种突变体的表达均得到证实，但它们表现出与表达野生型的细胞不同的光响应。从该结果中，我们发现Y224和Y309是参与OPN4光活化机制的氨基酸残基。此外，为了发现OPN4光激活机制的生理意义，我们计划使用腺相关病毒（AAV）在小鼠光敏视网膜神经节细胞（ipRGC）中表达突变的OPN4。为此，我们首先创建了一种 AAV，允许野生型 OPN4-mCherry 以 Cre 依赖性方式在感染细胞中表达。结果，我们获得了具有足够滴度感染小鼠 ipRGC 的 AAV。