Analysis of metastasis and growth of melanoma cells under irradiation of specific light exposure with Gq mutation

Gq突变特定光照射下黑色素瘤细胞的转移和生长分析

基本信息

批准号：
20H03849
负责人：
橋川和信
金额：
$ 11.32万
依托单位：
Nagoya University (2021-2023)Kobe University (2020)
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
财政年份：
2020
资助国家：
日本
起止时间：
2020-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-20H03849/
关键词：
メラノーマ Gq 青色光メラノプシン光受容転移 OPN4

项目摘要

虹彩に発生する悪性黒色腫(以下Melanoma)のうち、遠隔転移を起こした群ではGタンパク質ファミリーのうちGqαサブユニット群(以下Gq)の遺伝子変異が高率に認められること、また動物実験により、Gq遺伝子変異株ではMAPキナーゼ系の活性化(細胞増殖の活性化)および有意に転移をきたしたことが報告された。その後、Melanomaのみならず消化器系や呼吸器系に発生した悪性腫瘍においても同様の知見が報告されつつある。本研究の目的は、光とMelanomaの関連においてこれまで示されてきた「光線暴露が発生の危険因子である」ことに加え、「光線暴露は増殖・転移の危険因子でもある」ことを細胞生物学的に示すことにある。われわれは2つのMelanoma細胞株(MEWO株およびG361株)を研究対象として選んだ。昨年度までにGnaqをターゲットにR138Q変異の導入を行うためのCRISPR/CAS9を用いたベクターの配列およびssODNの配列(1塩基置換)を設計した。本年度はこれらをエレクトロポーレーションにより同時にMEWO株およびG361株に導入を行い、変異導入を確認するためにゲノム配列に対してPCRを行い、制限酵素処理ないしはGuide-it Mutation Detection Kitを用いて確認したが、いずれも切断が見られず、変異導入が否定された。次に、guide RNAを合成し、ssODNおよびCAS9タンパクを混じたものをエレクトロポーレーションし、Guide-it Mutation Detection Kitにより切断を確認したところ、MEWO株において一部切断が行われていることが確認でき、つまり、編集が行われたことが確認された。現在、限界希釈法によりクローンのスクリーニングを行なっている。

在发生于虹膜的恶性黑色素瘤中，G蛋白家族的Gqα亚基群（以下简称Gq）的基因突变在发生远处转移的群体中发现率较高，动物实验表明，据报道，Gq基因突变株激活了MAP激酶系统（激活细胞增殖）并显着转移。从那时起，不仅在黑色素瘤中，而且在消化系统和呼吸系统中发生的恶性肿瘤中也报道了类似的发现。这项研究的目的是证明，除了之前显示的关于光与黑色素瘤之间关系的“光暴露是发生黑色素瘤的危险因素”之外，“光暴露也是增殖的危险因素”和转移。”就是要科学地展示出来。我们选择了两种黑色素瘤细胞系（MEWO系和G361系）作为研究对象。到去年，我们使用CRISPR/CAS9设计了载体序列和ssODN序列（单碱基替换），以引入针对Gnaq的R138Q突变。今年，我们通过电穿孔将它们同时导入MEWO菌株和G361菌株中，对基因组序列进行PCR以确认突变引入，并使用限制酶处理或Guide-it突变检测试剂盒进行确认，但均未观察到切割。他们，并且排除了突变引入。接下来，合成引导RNA，对ssODN和CAS9蛋白的混合物进行电穿孔，并使用Guide-it突变检测试剂盒确认切割，并确认在MEWO菌株中发生了一些切割，这证实了编辑。制成。目前，我们正在使用有限稀释法筛选克隆。