メチルコバラミンを供与体とする新しいメチル化酵素の構造と反応機構に関する研究

以甲钴胺为供体的新型甲基转移酶的结构及反应机制研究

基本信息

批准号：
06660129
负责人：
日高智美
金额：
$ 1.28万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
财政年份：
1994
资助国家：
日本
起止时间：
1994 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

放線菌の生産する生理活性物質ビアラホス及びホスホマイシンの生合成経路に含まれる従来のメチル化酵素とは全く異なるメチルコバラミンを直接のメチル供与体とする2種の酵素(ビアラホスのP-メチラーゼ、ホスホマイシンのC-メチラーゼ)の構造と機能を明らかにすることを目的として研究を行ない以下の様な成果を得た。1.両酵素について遺伝子のクローン化及び塩基配列の決定を行ない、両者のアミノ酸配列の間に相同性があることを見出した。これにより両者の反応機構がメチルコバラミンをメチル供与体とする点において類似しているという申請者の仮説が強く支持された。2.両メチル化酵素とも無細胞系での活性は微弱であるので、メチルコバラミンの^<14>C-メチル標識体を調製し、高感度な活性の検出方法を検討した。その結果、極めて高感度な検出が可能であることが判明した。3.P-メチル化酵素遺伝子について大腸菌での高発現を試みた。本酵素遺伝子をヒスチジンヘキサマータグを有する組換え蛋白質を発現させるベクターに連結し、大腸菌での発現を検討したところ高発現が認められた。この組換え蛋白質はアフィニティーカラムを用いて一段階で精製することが可能である。しかしながら組換え蛋白質の大部分は不溶化しているため、今後はそれを活性のある状態に戻すことが重要な課題である。

我们对两种使用甲钴胺作为直接甲基供体的酶（双丙氨磷的P-甲基化酶，C-甲基化酶（C-甲基化酶）的结构和功能进行了研究，并获得了以下结果。 1.我们克隆了两种酶的基因并测定了它们的碱基序列，发现它们的氨基酸序列之间存在同源性。这有力地支持了申请人的假设，即两者的反应机制相似，都使用甲钴胺作为甲基供体。 2.由于两种甲基转移酶的活性在无细胞系统中都很弱，因此我们制备了14C-甲基标记形式的甲钴胺，并研究了检测其活性的高灵敏度方法。结果发现，极其灵敏的检测是可能的。 3.我们尝试在大肠杆菌中表达P-甲基转移酶基因。当将该酶基因连接到用于表达带有组氨酸六聚体标签的重组蛋白的载体并检查在大肠杆菌中的表达时，观察到高表达。这种重组蛋白可以使用亲和柱一步纯化。然而，由于大多数重组蛋白是不溶解的，使它们恢复活性状态将是未来的一个重要问题。