新しいエポキシ化反応を解媒する酵素の構造と反応機構に関する研究

催化新型环氧化反应的酶结构及反应机理研究

基本信息

批准号：
07660132
负责人：
日高智美
金额：
$ 1.28万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
财政年份：
1995
资助国家：
日本
起止时间：
1995 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-07660132/
关键词：
ホスホマイシンエポキシドエポキシ化酵素

项目摘要

申請者は放線菌の生産する抗生物質ホスホマイシンの生合成研究の過程で、ホスホマイシンのエポキシドが2級アルコール(ヒドロキシプロピルホスホン酸)の脱水素により生ずる新しいタイプのエポキシ化反応であることを見い出した。このホスホマイシンのエポキシ化酵素の精製、構造と反応機構の解明を目的として研究を行い、以下の成果を得た。1.ホスホマイシンを生産する放線菌Streptomyces wedmorensisより本酵素遺伝子をクローン化し、塩基配列を決定した。塩基配列より推定されるアミノ酸配列から本酵素は耐熱菌のアルコール脱水素酵素(NADP依存型)と低い相同性を有するとこが明らかとなった。さらに、大腸菌での本酵素の大量発現を検討しlacプロモーターを利用した大量発現に成功した。2.上記大腸菌酵素の活性測定の至適条件、安定化条件を検討し、精製を行った。イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲル濾過HPLCなどにより均一な精製に成功し、本酵素はサブユニット分子量26kDaの3量体であることが判明した。3.精製酵素を用いて生化学的諸性質、反応機構の検討を行った。その結果、反応至適温度は37℃、至適pHは7.0、基質であるヒドロキシプロピルホスホン酸に対するKm地は0.24mMであった。また、反応機構の検討の結果、このエポキシ化反応は好気条件で進行すること、反応には2価の鉄イオンが必須であること、反応の結果過酸化水素が生成することが明らかとなった。従って、本酵素は2価の鉄イオンを補因子とする酸化還元反応であることが判明した。

申请人在放线菌类抗生素磷霉素的生物合成研究过程中，发现磷霉素的环氧化物是仲醇（羟丙基膦酸）脱氢产生的一种新型环氧化反应。我们对该磷霉素环氧化酶进行了纯化并阐明了其结构和反应机理，得到了以下结果。 1.从生产磷霉素的Streptomyces wedmorensis中克隆酶基因，并测定其核苷酸序列。从核苷酸序列推导的氨基酸序列表明，该酶与耐热细菌的乙醇脱氢酶(NADP依赖型)具有较低的同源性。此外，我们研究了该酶在大肠杆菌中的大规模表达，并成功使用 lac 启动子进行了大规模表达。 2. 研究了测定大肠杆菌酶活性的最佳条件和稳定条件，并进行了纯化。采用离子交换层析、疏水层析、凝胶过滤HPLC等方法成功地将酶纯化至均质，发现酶为三聚体，亚基分子量为26 kDa。 3.对纯化后的酶的生化性质及反应机理进行了研究。结果表明，最适反应温度为37℃，最适pH为7.0，相对于底物羟丙基膦酸的Km为0.24mM。此外，研究反应机理的结果表明，该环氧化反应在有氧条件下进行，二价铁离子对于该反应是必需的，并且作为反应的结果，生成过氧化氢。因此，表明该酶使用二价铁离子作为辅助因子进行氧化还原反应。