新しいエポキシ化反応を解媒する酵素の構造と反応機構に関する研究

催化新型环氧化反应的酶结构及反应机理研究

基本信息

批准号：
07660132
负责人：
日高智美
金额：
$ 1.28万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
财政年份：
1995
资助国家：
日本
起止时间：
1995 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-07660132/
关键词：
ホスホマイシンエポキシドエポキシ化酵素

项目摘要

申請者は放線菌の生産する抗生物質ホスホマイシンの生合成研究の過程で、ホスホマイシンのエポキシドが2級アルコール(ヒドロキシプロピルホスホン酸)の脱水素により生ずる新しいタイプのエポキシ化反応であることを見い出した。このホスホマイシンのエポキシ化酵素の精製、構造と反応機構の解明を目的として研究を行い、以下の成果を得た。1.ホスホマイシンを生産する放線菌Streptomyces wedmorensisより本酵素遺伝子をクローン化し、塩基配列を決定した。塩基配列より推定されるアミノ酸配列から本酵素は耐熱菌のアルコール脱水素酵素(NADP依存型)と低い相同性を有するとこが明らかとなった。さらに、大腸菌での本酵素の大量発現を検討しlacプロモーターを利用した大量発現に成功した。2.上記大腸菌酵素の活性測定の至適条件、安定化条件を検討し、精製を行った。イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲル濾過HPLCなどにより均一な精製に成功し、本酵素はサブユニット分子量26kDaの3量体であることが判明した。3.精製酵素を用いて生化学的諸性質、反応機構の検討を行った。その結果、反応至適温度は37℃、至適pHは7.0、基質であるヒドロキシプロピルホスホン酸に対するKm地は0.24mMであった。また、反応機構の検討の結果、このエポキシ化反応は好気条件で進行すること、反応には2価の鉄イオンが必須であること、反応の結果過酸化水素が生成することが明らかとなった。従って、本酵素は2価の鉄イオンを補因子とする酸化還元反応であることが判明した。

在放线菌产生的抗生素fosfymycin的生物合成研究中，申请人发现，Fosfomycin的环氧是通过二氢化二醇（羟基丙基磷酸化）脱氢产生的一种新型的环氧化反应。进行研究的目的是纯化这种fosfomycin的环氧化酶并阐明结构和反应机制，并获得以下结果。 1。从产生fosfomycin的放线菌链霉菌链霉菌链霉菌链霉菌克隆的酶基因，并确定碱基序列。从碱基序列推导的氨基酸序列表明，该酶与耐热细菌的酒精脱氢酶（NADP依赖性类型）的同源性较低。此外，研究了该酶在大肠杆菌中的大量表达，并使用LAC启动子成功实现了大型表达。 2。在检查了大肠杆菌活性的最佳条件和稳定条件后，进行了隐私。均质纯化通过离子交换色谱，疏水色谱，凝胶过滤HPLC等成功地进行，并且发现该酶是一种三聚体，亚基分子量为26 kDa。 3。使用纯化的酶研究了生化特性和反应机制。结果，反应的最佳温度为37°C，最佳pH值为7.0，底物羟丙基磷酸的Km为0.24 mm。此外，由于对反应机制的研究，据揭示了这种环氧反应在有氧条件下进行，二价铁离子对于反应至关重要，并且由于反应而产生过氧化氢。因此，发现该酶是一种氧化还原反应，其中将二价铁离子用作辅因子。