歯髄および歯根膜細胞からの間葉系幹細胞分離法の樹立

牙髓、牙周膜细胞中分离间充质干细胞方法的建立

• 批准号: 14657517
• 负责人: 朝比奈 泉
• 金额: $ 2.11万
• 依托单位: The University of Tokyo (2003)Tokyo Medical and Dental University (2002)
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2002
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2002 至 2003
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-14657517/
• 关键词: 歯髄; 歯乳頭; 歯根膜; 幹細胞; 再生医療; 再生療法; 歯槽骨再生; 埋伏智歯

昨年度の本研究で、ヒト歯髄および歯根膜由来細胞は、その石灰化能に個体差が大きいことが分かった。そこで、安定した研究成果を得るために、不死化した細胞株を用い硬組織形成の検討を行った。1)歯乳頭、歯髄、歯根膜由来細胞の不死化インフォームドコンセントのもとに抜去した智歯より、以下の細胞を調製した。すなわち、わずかに歯冠部に石灰化のみられた鐘状器の歯乳頭、歯根の完成した崩出智歯の歯髄、および歯根膜からコラゲナーゼ処理法により細胞を回収した。これらの細胞に、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素(hTERT)をヒトパピローマウイルス16(HPV16)あるいはSV40と共に細胞に導入した。これらの細胞は約30継代以上生存することが確認できた。2)in vitroにおける細胞増殖、石灰化能の検討歯乳頭細胞(PA)と歯髄細胞(DP)は紡錘形をしたやや小型の細胞で、高い増殖活性を示した。デキサメタゾン、アスコルビン酸およびグリセロリン酸を添加した培地で培養することにより、アルカリフォスファターゼ活性の上昇を認めた。PAはDPに較べ多くの石灰化結節を形成した。しかし、これらの細胞はBMPに対する応答性を欠いていた。一方、歯根膜細胞は(PL)長い突起をもつやや大型の紡錘形細胞で、倍加時間が4-5日と増殖能は低かった。低いアルカリフォスファターゼ活性を示すが、石灰化能はなかった。RT-PCRによってPA、DPはDSPPを強く発現していることを確認した。3)in vivo石灰化能の検討PA、DPをPLLAメッシュ、これにヒドロキシアパタイト薄層コーティングを施したもの(HA-PLLA)あるいは多孔質TCPに播種し、ヌードマウス背部皮下に移植した。6週後に摘出し組織学的検討を行った結果、HA-PLLAにPAを播種したものだけに石灰化像を認めた。この石灰化組織周囲には、骨芽細胞あるいは象牙芽細胞様の細胞を認めなかった。以上の結果から、これらの細胞は、歯胚再生研究に有用であることが示唆された。

去年的研究表明，人类牙髓和牙周膜来源的细胞的钙化能力存在较大的个体差异。因此，为了获得稳定的研究结果，我们使用永生化细胞系研究硬组织的形成。 1)来自牙乳头、牙髓和牙周膜的细胞的永生化从知情同意下拔出的智齿制备以下细胞。即，通过胶原酶处理从牙冠中具有轻微钙化的钟形器官的牙乳头、具有完整牙根的拔出智齿的牙髓以及牙周膜收集细胞。将人端粒酶逆转录酶 (hTERT) 与人乳头瘤病毒 16 (HPV16) 或 SV40 一起引入这些细胞中。已证实这些细胞存活约30代或更长时间。 2)体外细胞增殖和矿化能力检测牙乳头细胞(PA)和牙髓细胞(DP)均为纺锤形，细胞较小，表现出较高的增殖活性。通过在补充有地塞米松、抗坏血酸和甘油磷酸的培养基中培养，观察到碱性磷酸酶活性的增加。 PA 比 DP 形成更多的钙化结节。然而，这些细胞缺乏对 BMP 的反应。另一方面，牙周膜细胞（PL）是相当大的纺锤形细胞，突起较长，增殖能力低，倍增时间为4-5天。其碱性磷酸酶活性较低，但无钙化能力。 RT-PCR证实PA和DP强表达DSPP。 3)体内钙化能力检测将PA和DP接种在涂有一层薄层羟基磷灰石(HA-PLLA)或多孔TCP的PLLA网上，并植入裸鼠背部皮下。 6周后，取出标本并进行组织学检查，结果仅在接种有PA的HA-PLLA中观察到钙化。在该钙化组织周围没有观察到成骨细胞或成牙本质细胞样细胞。上述结果表明这些细胞可用于牙胚再生研究。

项目成果

Imaizumi F, Asahina I, Moriyama T, Ishii M, Omura K.: "Cultured mucosal cell sheet with a double layer of keratinocytes and fibroblasts on a collagen membrane."Tissue Engineering. (in press). (2004)

Imaizumi F、Asahina I、Moriyama T、Ishii M、Omura K.：“在胶原膜上培养具有双层角质形成细胞和成纤维细胞的粘膜细胞片。”组织工程。

Alam MI, Asahina I, Seto I, Oda M, Enomoto S: "Prefabrication of vascularized bone flap induced by recombinant human bone morphogenetic protein 2 (rhBMP-2)."Int.J.Oral Maxillofac.Surg.. 32. 508-514 (2003)

Alam MI、Asahina I、Seto I、Oda M、Enomoto S：“重组人骨形态发生蛋白 2 (rhBMP-2) 诱导的血管化骨瓣预制。”Int.J.Oral Maxillofac.Surg. 32. 508-