植物の新規な遺伝子ベクターの開発

新型植物基因载体的开发

基本信息

批准号：
14656127
负责人：
福原敏行
金额：
$ 2.18万
依托单位：
Tokyo University of Agriculture and Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2002
资助国家：
日本
起止时间：
2002 至 2003
项目状态：
已结题

项目摘要

日本型イネには、宿主に明確な病徴を示さず、種子及び花粉による垂直伝播のみが認められるといったプラスミド様性質を示す2本鎖RNAレプリコンが存在する。本研究は、イネ2本鎖RNAのプラスミド的な諸性質を利用して、植物における全く新しいタイプの遺伝子ベクター開発を目的とする。遺伝子導入用コンストラクトは、イネ2本鎖RNAの両末端をRT-PCRで増幅しT7プロモーターを付加したDNA断片に、選抜マーカーとしてハイグロマイシン抵抗性遺伝子およびレポーター遺伝子として緑色蛍光タンパク質(GFP)遺伝子を組み込んだものを作製した。このコンストラクトよりin vitroで転写したRNAを直接パーティクルガンで2本鎖RNAを保持するイネカルスに打ち込んだ。打ち込んだRNAは、複製酵素遺伝子を欠いているため、それ自身では複製できないが、2本鎖RNAを含むカルスに導入することにより、内在する2本鎖RNAがコードする複製酵素により複製し、ベクターとして機能することを期待している。RT-PCRで増幅する2本鎖RNAの両末端について400bp-1,500bpの範囲で種々の長さのコンストラクトを作成、2本鎖RNAを持つイネカルス(日本晴品種)に導入し、ハイグロマイシンを用いた選抜および緑色蛍光の観察等を行った結果、導入したハイグロマイシンおよびGFP遺伝子の発現が示唆された。これら遺伝子の発現を確認するため、導入したRNAの有無をノーザンハイブリダイゼーションにて解析したが、シグナルは検出できなかった。RT-PCRでは、GFP遺伝子RNAの存在が確認できたことから、導入したコンストラクトは一時的には複製するものの、その後の複製・維持に問題がある可能性が示唆された。より安定性の高いベクター開発を目標に実験を続けている。

日本大米具有双链RNA复制子，具有类似质粒的特性，宿主没有明显的疾病迹象，只有种子和花粉的垂直传播。这项研究旨在利用稻米双链RNA的质粒样性质开发植物中一种全新的遗传载体。通过将RT-PCR掺入稻米双链RNA的两端来制备基因转移构建体，以将T7启动子添加到DNA片段中，其中氢霉素耐药基因和绿色荧光蛋白（GFP）基因作为可选标记。从该构建体中，将体外转录的RNA直接植入水稻愈伤组织中，该愈伤组织使用粒子枪携带双链RNA。植入的RNA缺乏复制的酶基因，无法复制，但是通过将其引入包含双链RNA的愈伤组织中，可以预期它将通过由固有的双链RNA和功能作为载体编码的复制酶复制来复制。 Constructs of various lengths ranging from 400bp to 1,500bp at both ends of the double-stranded RNA amplified by RT-PCR were created, and the results were introduced into rice callus (Nihonbari variety) with double-stranded RNA, and were selected using hygromycin and observed with green fluorescence, suggesting the expression of the introduced hygromycin and GFP genes.为了确认这些基因的表达，通过北部杂交分析了引入的RNA的存在或不存在，但无法检测到信号。在RT-PCR中证实了GFP基因RNA的存在，这表明尽管引入的构造暂时复制，但随后的复制和维护可能存在问题。我们继续进行实验，目的是开发更稳定的向量。