植物の新規な遺伝子ベクターの開発

新型植物基因载体的开发

基本信息

批准号：
14656127
负责人：
福原敏行
金额：
$ 2.18万
依托单位：
Tokyo University of Agriculture and Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2002
资助国家：
日本
起止时间：
2002 至 2003
项目状态：
已结题

项目摘要

日本型イネには、宿主に明確な病徴を示さず、種子及び花粉による垂直伝播のみが認められるといったプラスミド様性質を示す2本鎖RNAレプリコンが存在する。本研究は、イネ2本鎖RNAのプラスミド的な諸性質を利用して、植物における全く新しいタイプの遺伝子ベクター開発を目的とする。遺伝子導入用コンストラクトは、イネ2本鎖RNAの両末端をRT-PCRで増幅しT7プロモーターを付加したDNA断片に、選抜マーカーとしてハイグロマイシン抵抗性遺伝子およびレポーター遺伝子として緑色蛍光タンパク質(GFP)遺伝子を組み込んだものを作製した。このコンストラクトよりin vitroで転写したRNAを直接パーティクルガンで2本鎖RNAを保持するイネカルスに打ち込んだ。打ち込んだRNAは、複製酵素遺伝子を欠いているため、それ自身では複製できないが、2本鎖RNAを含むカルスに導入することにより、内在する2本鎖RNAがコードする複製酵素により複製し、ベクターとして機能することを期待している。RT-PCRで増幅する2本鎖RNAの両末端について400bp-1,500bpの範囲で種々の長さのコンストラクトを作成、2本鎖RNAを持つイネカルス(日本晴品種)に導入し、ハイグロマイシンを用いた選抜および緑色蛍光の観察等を行った結果、導入したハイグロマイシンおよびGFP遺伝子の発現が示唆された。これら遺伝子の発現を確認するため、導入したRNAの有無をノーザンハイブリダイゼーションにて解析したが、シグナルは検出できなかった。RT-PCRでは、GFP遺伝子RNAの存在が確認できたことから、導入したコンストラクトは一時的には複製するものの、その後の複製・維持に問題がある可能性が示唆された。より安定性の高いベクター開発を目標に実験を続けている。

日本水稻具有双链RNA复制子，表现出类似质粒的特性，在宿主体内没有明显的疾病症状，仅通过种子和花粉垂直传播。本研究旨在利用水稻双链RNA的类质粒特性，开发一种全新的植物基因载体。该基因导入构建体由通过RT-PCR扩增水稻双链RNA两端并添加T7启动子的DNA片段、作为选择标记的潮霉素抗性基因和绿色荧光蛋白(GFP)基因组成。我制作了一个包含它的报告基因。使用粒子枪将在体外从该构建体转录的RNA直接注射到保留双链RNA的水稻愈伤组织中。植入的RNA由于缺乏复制酶基因而无法自行复制，但通过将其导入含有双链RNA的愈伤组织中，它可以通过内源双链RNA编码的复制酶进行复制，成为载体。它将发挥这样的作用。通过RT-PCR扩增双链RNA的两端，制作400bp至1,500bp的各种长度的构建体，导入含有双链RNA的水稻愈伤组织(日本晴品种)中，并使用潮霉素作为载体。选择和观察绿色荧光的结果表明导入的潮霉素和GFP基因得到表达。为了确认这些基因的表达，通过Northern杂交分析了导入的RNA的存在与否，但没有检测到信号。 RT-PCR证实了GFP基因RNA的存在，这表明虽然引入的构建体可以暂时复制，但随后的复制和维持可能存在问题。我们正在继续进行实验，目标是开发更稳定的载体。