記億喪失性貝毒原因藻の培養液中の細菌における抗ドウモイ酸抗体と反応するペプチド

与遗忘性贝类毒藻培养物中细菌中的抗软骨藻酸抗体发生反应的肽

• 批准号: 14656083
• 负责人: 児玉 正昭
• 金额: $ 2.11万
• 依托单位: Kitasato University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2002
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2002 至 2004
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-14656083/
• 关键词: ドウモイ酸; 記憶喪失性貝毒; 抗体; western blotting; ELISA; protease; タンパク; 抗ドウモイ酸抗体; 細菌; ドウモイ酸結合タンパク; thorny oyster; Pseudo-nitzschia

ドウモイ酸のカルボキシル基にBranaらの方法に従いウシ血清アルブミン(BSA)を結合したものを抗原として抗体を作成した。本抗体を用いるwestern blottingで細菌タンパク中に抗体で染色される1本のバンドを観察した。前年度は抗体との反応を指標に本タンパクの精製を試みたが、含量が少なく精製に至らなかった。一方、western biottingで種々の貝類のタンパク画分をスクリーニングしたところ、ホタテガイおよびイワガキに強い反応が認められた。これらタンパク中の抗体と反応している成分がドウモイ酸であるか否かをまず明らかにするために、同成分を含む画分を非特異的proteaseで消化して消化物中の抗体と反応する成分を上記抗体を用いるELISAで検討した。消化物を分子量5000の膜でろ過し、ろ液をELISAで分析したところ強い反応が認められた。しかし、これをドウモイ酸分析用HPLCで分析したところドウモイ酸に相当するピークは認められなかった。このことは試料中の抗ドウモイ酸抗体に反応する物質はドウモイ酸そのものではないことを示すものである。消化に用いたproteaseはペプチド結合を加水分解し、タンパクとドウモイ酸が他の結合様式で結合している場合は本酵素による消化ではドウモイ酸は遊離しない。これを明らかにするには本物質の構造を解析する必要がある。そこでELISAに対する反応を指標に逆相ODSカラムを用いるHPLCにより本物質の精製を試み、ELISAと反応する物質が1成分であり、HPLCを繰り返すことによりこれを高度に精製できることが明らかになった。現在構造解析に必要な量の物質の精製を進めている。

按照Brana等人的方法，使用与软骨藻酸的羧基结合的牛血清白蛋白(BSA)作为抗原制备抗体。在使用该抗体的蛋白质印迹中，在细菌蛋白质中观察到用该抗体染色的单条带。去年，我们尝试以与抗体的反应为指标来纯化这种蛋白质，但量太少而无法纯化。另一方面，当使用西方生物技术筛选各种贝类的蛋白质组分时，在扇贝和岩牡蛎中观察到强烈的反应。为了首先明确这些蛋白质中与抗体反应的成分是否是软骨藻酸，我们用非特异性蛋白酶消化含有相同成分的级分，并使用上述酶联免疫吸附试验(ELISA)检查了与消化产物中的抗体反应的成分。抗体。当消化产物通过分子量为5000的膜过滤并通过ELISA分析滤液时，观察到强烈的反应。然而，当通过用于软骨藻酸分析的HPLC对其进行分析时，没有观察到与软骨藻酸对应的峰。这表明与样品中的抗软骨藻酸抗体反应的物质不是软骨藻酸本身。用于消化的蛋白酶水解肽键，如果蛋白质和软骨藻酸以其他方式结合，则用该酶消化就不会释放软骨藻酸。为了弄清楚这一点，有必要分析这种物质的结构。因此，我们尝试以ELISA反应为指标，使用反相ODS柱，通过HPLC纯化该物质，结果发现其中一种成分是与ELISA反应的物质，并且可以通过以下方法对其进行高度纯化：重复HPLC。我们目前正在纯化结构分析所需的材料量。