植物のγ-グルタミルシステイン合成酵素の精製と機能解析

植物γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的纯化及功能分析

• 批准号: 07660081
• 负责人: 關谷 次郎
• 金额: $ 1.15万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• 财政年份: 1995
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1995 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-07660081/
• 关键词: γ-グルタミルシステイン合成酵素; グルタチオン; ホウレンソウ; 酵素精製

グルタチオン(あるいはホモグルタチオン)は植物において細胞内の酸化還元状態を規定するとともに、各種のストレスに対しても重要な役割を演じているといわれている.ダイズをイオウ欠乏下で栽培してホモグルタチオン含量を低下させるとパラコートに対する感受性が増加した.植物においてもグルタチオンはγ-グルタミルシステイン合成酵素(GCS)とグルタチオン合成酵素によって生合成されるといわれている.しかし高等植物からのGCSは未だ精製されておらず,本研究ではGCSの精製と特性を明らかにすることを目的とした.GCSの活性測定法は,動物ではATPの加水分解による分解物の定量から活性を求めているが,植物ではリン酸エステル分解活性が高いためこの方法では活性測定が不可能であった.そこで活性測定法について検討し,グルタミン酸とステインを基質とし生成物のチオール基を螢光修飾してHPLCで分析定量する方法,およびグルタミン酸とα-アミノ酪酸からの生成物(標品を有機合成)をアミノ酸分析法で定量する方法を確立した.植物のGCS活性は一般に大腸菌などに比べて低いので大量のホウレンソウを用いて本酵素の精製を試みた.粗酵素液を硫安分画後、DEAE-cellulose,Phenyl-Sepharose,Hydroxyapatiteなどのカラムクロマトグラフィーで精製を試みた.しかし比活性は10倍程度上昇したが,精製中の酵素の失活が激しく,2段階のクロマトグラフィーですべての活性が失われた。種々のプロテアーゼ阻害剤,チオール保護試薬,脱酸素処理などを試みたが,酵素の失活は防ぐことはできなかった.さらにγ-グルタミルシステインをリガンドとするアフィニテイクロマトグラーフィを試みたが吸着しなかった.従って本酵素蛋白を精製するためには、安定化の因子を見いだすことが重要であると結論した.

据说谷胱甘肽（或同型硫酸盐）可以调节植物细胞内的氧化还原状态，并在各种应力​​中起重要作用。当大豆在硫缺乏症下种植并降低均谷胱甘肽含量时，对帕拉菌的敏感性会增加。据说谷胱甘肽是通过γ-谷氨酰半胱氨酸合酶（GCS）和谷胱甘肽合酶在植物中生物合成的。但是，较高植物的GC尚未纯化，这项研究旨在阐明GC的纯化和表征。 The activity of GCS is determined in animals from the quantification of degradation products by hydrolysis of ATP, but in plants, this method is used to determine the activity of GCS.水方法合物合物合物合物合物合物合物合物合物合物合物合物合物合物合物合物合物合物合物合物合物合物合物合物合物合物合物。 Therefore, we have established a method of quantifying the thiol groups of the product using glutamic acid and stain as substrates, and a method of quantifying the product by HPLC, and an amino acid analysis method of quantifying the products (preparations are organic synthesis) from使用氨基酸分析，谷氨酸和α-氨基丁酸。由于植物的GCS活性通常低于大肠杆菌的活性，因此我们尝试使用大量菠菜纯化该酶。在分馏粗酶溶液硫酸铵之后，我们试图通过柱色谱法纯化它，例如Deae-纤维素，苯基 - 塞磷脂，羟基磷灰石等。尽管特异性活性增加了约10次，但在纯化过程中均丢失了酶，并且在两个阶段中都失去了酶。尽管尝试了各种蛋白酶抑制剂，硫醇保护试剂和脱氧处理，但并未阻止酶失活。此外，尝试使用γ-谷氨酰基半胱氨酸作为配体的兴奋剂色谱法，但没有吸附。因此，结论是，找到纯化酶蛋白的稳定因子很重要。