新規鎖状ポリエン抗生物質エナシロキシンの生合成に関与する酸化酵素に関する研究

新型线性多烯抗生素烯酰氧生物合成中氧化酶的研究

• 批准号: 05660079
• 负责人: 伊崎 和夫
• 金额: $ 1.34万
• 依托单位: Tohoku University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• 财政年份: 1993
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1993 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-05660079/
• 关键词: エナシロキシン; エナシロキシン酸化酵素; Frateuria; ピロロキノリンキノン; エナシロキシン酸化酵素補酵素

エナシロキシンIIa生合成の中間体と思われるエナシロキシンIVaを酸化して、エナシロキシンIIaとするエナシロキシン酸化酵素が生産菌の培養上清に見いだされ、この酸化酵素の精製を試みた。アカパンカビNeurospora crassa IFO 6068株をCzapek-Dox培地で培養し、その培養上清にFrateuria W315株を30℃30時間培養した。その遠心上清を粗酵素液とし、限外ろ過、超遠心、硫安塩析、Butyl-Toyopearl 650M,Hydroxylapatite等を用いて精製した。その結果SDS-PAGEにおいて単一なバンドとなる標品が得られ、非活性は170倍に上昇した。SDS-PAGEとゲルろ過(FPLC)により、分子量はそれぞれ約73kDa、約79kDaと推定され、本酵素はモノマーであることが示唆された。また至適温度は60℃、至適pHは9.0、等電点は6.2であった。基質としてはエナシロキシンIVaおよびIIIa以外は全く反応せず、特異性が非常に高かった。本酵素はMg^<2+>、Ca^<2+>を要求し、二価の重金属イオンやカルボニル試薬により阻害され、キレート剤、SH試薬そしてKCNやNaN_3等により殆ど影響を受けなかった。また本酵素から補酵素を取り除いたアポ型の酵素にピロロキノリンキノン(PQQ)とMg^<2+>を添加したところ活性が回復した。しかし本酵素から単離した補酵素画分のスペクトル解析によりPQQと異なる吸収ピークが検出され、また薄層クロマトグラフィでもRF値が異なるので、PQQ類縁ではあるが新しい補酵素である可能性が示唆された。

在生产细菌的培养上清液中发现了烯酰氧基氧化酶，该酶氧化被认为是烯酰氧基IIa生物合成中间体的烯酰氧基IVa，并将其转化为烯酰氧基IIa，我们尝试纯化该氧化酶。将粗糙脉孢菌IFO 6068株在Czapek-Dox培养基中培养，并将Frateuria W315株在培养上清液中于30℃培养30小时。离心上清液作为粗酶液，采用超滤、超速离心、硫酸铵盐析、Butyl-Toyopearl 650M、Hydroxylapatite等纯化。结果，获得了在SDS-PAGE上具有单一条带的样品，并且无活性增加了170倍。通过 SDS-PAGE 和凝胶过滤 (FPLC) 估计分子量分别约为 73 kDa 和约 79 kDa，表明该酶是单体。最适温度为60℃，最适pH为9.0，等电点为6.2。除enacyloxin IVa和IIIa以外的底物完全不反应，表明特异性极高。该酶需要Mg^2+和Ca^2+，受二价重金属离子和羰基试剂抑制，几乎不受螯合剂、SH试剂、KCN、NaN_3等影响。此外，当将吡咯并喹啉醌(PQQ)和Mg 2+ 加入到通过从该酶除去辅酶而获得的脱辅基型酶中时，活性恢复。然而，对该酶分离的辅酶组分的光谱分析检测到与PQQ不同的吸收峰，并且薄层色谱也显示出不同的RF值，表明它可能是一种新的辅酶，尽管它与PQQ Ta有关。

项目成果

T.Watanbe,T.Sugiyama,K.Izaki: "New polyenic antibiotics active against Gram-positive and Gram-negative bacteria IX.Reclassification of a strain producing enacyloxin" J.Antibiotcis. 47 No.4. 413-415 (1994)

T.Watanbe、T.Sugiyama、K.Izaki：“对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌具有活性的新型多烯抗生素 IX。产生烯酰霉素的菌株的重新分类”J.Antibiotcis。