グリセロアルデヒド3燐酸脱水素酵素のリガンド結合協同性の解析

三磷酸甘油醛脱氢酶配体结合协同性分析

基本信息

批准号：
01480060
负责人：
太田隆久
金额：
$ 4.22万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for General Scientific Research (B)
财政年份：
1989
资助国家：
日本
起止时间：
1989 至 1990
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-01480060/
关键词：
アロステリックリガンド結合協同性オリゴマ-酵素耐熱性

项目摘要

昨年度において高度好熱性細菌のグリセロアルデヒド3燐酸脱水素酵素(GAPDH)の大量発現系を確立して大腸菌で生産させた酵素について部位特異的異変を導入して解析したが、この酵素の高度な安定性のために、そのままでは、所期の目的を達成するのが困難であった。そこで先ず、ビフィズス菌のLー乳酸脱水素酵素(LDH)を用いてリガンド結合協同性のモデル実験を試みた。本酵素は高度好熱性細菌の酵素より安定度は低いが、中温菌酵素としてはかなり高い安定性を有し、またクロ-ニンングした遺伝子が大腸菌中で良好な発現をする点で有利である。また、基質およびアロステリックエフェクタ-であるフルクト-ス1,6-二燐酸により酵素に正の協同性を生ずることから、グリセロアルデヒド3燐酸脱水素酵素の負の協同性と対象的なモデルとなるためである。リガンド結合性を変化させたLDHサブユニットのハイブリッドの分離を行うために酵素蛋白質のC末端に正および負の電荷のアミノ酸残基を導入した変異株を作成した。これら変異株およびそれを用いて大腸菌中で作成したサブユニットハイブリッドはHPLにより分離された。一方、リガンド結合性について基質ピルビン酸に対する認識をオキザロ酢酸にかえた変異、あるいはフルクト-ス1,6-二燐酸の結合性を無くした変異をもつサブユニットを作成し、上記変異との複合変異株によりリガンド結合性の異なるサブユニットのハイブリッド酵素の特性を解析した。この解析により、正のリガンド結合協同性はアロステリック現象の協奏型モデルに適合することを分子的に証明した。このモデル実験によりグリセロアルデヒド3燐酸デヒドロゲナ-ゼの負の協同性についても解析が行える見通しが得られた。

去年，我们建立了高嗜热细菌甘油醛三磷酸脱氢酶（GAPDH）的大规模表达系统，并通过引入位点特异性突变来分析大肠杆菌中产生的酶，由于其性质，很难实现这种酶的表达。原本的预期目的。首先，我们尝试使用双歧杆菌 L-乳酸脱氢酶 (LDH) 进行配体结合协同性模型实验。尽管该酶的稳定性低于高度嗜热细菌酶的稳定性，但其作为嗜温细菌酶具有相当高的稳定性，并且具有克隆的基因在大肠杆菌中良好表达的优点。此外，由于底物和变构效应物果糖1,6-二磷酸在酶中产生正协同作用，因此该模型与甘油醛三磷酸脱氢酶的负协同作用相当。为了分离具有改变的配体结合特性的LDH亚基杂合体，我们创建了突变株，其中在酶蛋白的C末端引入带正电荷和带负电荷的氨基酸残基。这些突变菌株和在大肠杆菌中使用它们创建的亚基杂交体通过 HPL 进行分离。另一方面，我们创建了一个亚基，该亚基具有将配体结合的底物丙酮酸的识别改变为草酰乙酸的突变，或者消除了果糖-1,6-二磷酸的结合的突变，并将突变与上述突变组合起来。我们分析了杂合酶的特征，其亚基根据菌株具有不同的配体结合特性。该分析从分子角度证明了正配体结合协同性符合变构现象的协调模型。该模型实验为我们分析三磷酸甘油醛脱氢酶的负协同性提供了前景。