臨床展開を目指したヒト胚性幹細胞からの成熟赤血球作製の基盤技術開発

开发利用人胚胎干细胞生产成熟红细胞的基础技术并进行临床开发

基本信息

批准号：
19659263
负责人：
梅田雄嗣
金额：
$ 2.11万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2007
资助国家：
日本
起止时间：
2007 至 2008
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-19659263/
关键词：
胚性幹細胞赤血球分化輸血

项目摘要

昨年度に開発した、完全に動物由来の細胞および血清を取り除いた培養条件で未分化ヒト胚性幹細胞(ES細胞)から成熟血球を大量産生するin vitro培養システムにおいて、産生される血球の性状を中心に検討を行った。ヒトES細胞をマトリゲル上で血清を含まない条件で培養を継続し、無フィーダー細胞条件下で少量のアルブミン・BMP-4・VEGFを添加した培養条件で初期培養を行った。造血系前駆細胞の表面マーカーであるVEGFR-2、CD34陽性細胞が出現する分化誘導開始4日目以降の細胞をマウスストローマ細胞であるOP9細胞上にまきなおしてEPO・IL-3・SCF・TPO存在下で培養を継続し、産生される血液細胞の性状を検討した。浮遊血液細胞のメイ・ギムザ染色では赤血球・好中球・巨核球の出現が確認された。また、出現する浮遊赤血球を抗ヘモグロビン抗体の免疫染色、およびヘモグロビン遺伝子のリアルタイムRT-PCRの継時的解析では培養初期には胚型ヘモグロビン陽性のヒト卵黄嚢由来の赤血球が、そして後期には胎児型・成人型ヘモグロビン陽性のヒト胎児肝由来の赤血球が出現する事が判明した。この培養システムはヒトES細胞から発生学的にヒト胚と同等の血液細胞発生を再現する事が可能であった。今後はさらに培養法法を改良し、輸血可能な成熟成人型赤血球のex vivo増殖の基盤技術の開発を目指していく予定である。

我们着眼于去年开发的体外培养系统中产生的血细胞的特性，该系统在完全排除动物来源细胞和血清的培养条件下，从未分化的人类胚胎干细胞（ES细胞）中产生大量成熟的血细胞。进行以下研究。人ES细胞在无血清条件下在Matrigel上连续培养，并在无饲养条件下添加少量白蛋白、BMP-4和VEGF进行初始培养。分化诱导开始后第4天，当VEGFR-2和CD34阳性细胞（造血祖细胞的表面标志物）出现时，将细胞重新铺板到OP9细胞（小鼠基质细胞）和EPO、IL上添加-3、SCF和TPO，在这些细胞存在下继续培养，并检查所产生的血细胞的特性。漂浮血细胞的 May-Giemsa 染色证实了红细胞、中性粒细胞和巨核细胞的出现。此外，对出现的漂浮红细胞进行免疫染色以及对血红蛋白基因的实时RT-PCR的连续分析表明，在培养的早期阶段就发现了来自人卵黄囊的红细胞，其对胚胎血红蛋白呈阳性。，并在培养后期发现了胎儿型红细胞和成人型血红蛋白阳性的源自人胎儿肝脏的红细胞。该培养系统能够从人类胚胎干细胞中复制出血细胞发育，其胚胎学与人类胚胎相当。未来，我们计划进一步改进培养方法，旨在开发可输血的成熟成人红细胞离体增殖的基础技术。