骨格筋の発火に必須の新規遺伝子SH3P1の機能解析、及び疾患との関連

骨骼肌放电必需基因SH3P1的功能分析及其与疾病的关系

基本信息

批准号：
19650101
负责人：
平田普三
金额：
$ 2.05万
依托单位：
Nagoya University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2007
资助国家：
日本
起止时间：
2007 至 2008
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-19650101/
关键词：
筋変異体

项目摘要

研究代表者はエチルニトロソウレアを変異原に用いて変異体スクリーニングを行い、ピンセットでつつく刺激を与えてもほとんど動かない変異体を単離した(以下、これを単に変異体と呼ぶ)また、この変異はメンデル遺伝することから単一の遺伝子の変異によるものと思われたが、実際に責任遺伝子のマッピングを行い、変異を6番染色体上の50kbの領域にしぼり、さらにその領域にある遺伝子をクローニング、シークエンスすることで、新規遺伝子SH3P1に変異を見いだした。SH3P1のイントロンのスプライシングアクセプター部位に点変異があり、選択的スプライシングに異常が生じて終止コドンが生じるため、正常なSH3P1タンパクが合成されないことを見出した。本研究はSH3P1の機能を解明することで、この変異体における運動異常のメカニズムを明らかにし、その知見のヒト疾患への応用を目指すものである。電気生理実験をさらにおし進め、運動時の筋電位変化をパッチクランプ法で測定する実験を行った。運動を誘発する触刺激のシグナルは感覚ニューロン→介在ニューロン(脳)→運動ニューロンを介して筋に伝えられ、正常個体の場合では30Hzの脱分極を筋で起こすことが知られているが、変異体でも30Hzの電位変化が同様に観察されたことから、変異体では筋に異常があることが示唆された。実際にSH3P1のmRNA発現を調べると、筋で強いシグナルが見られた。これは筋に異常があることと合致する結果である。また、SH3P1を特異的に認識するモノクローナル抗体の作製をし、局在の解析を試みたが、免疫染色で明確な細胞内局在は分からなかったが、筋細胞全体でシグナルが検出された。アンチセンスモルフォリノを用いたノックダウン実験で、変異体の表現系がコピーできたこと、正常型mRNAを導入するレスキュー実験で変異体の運動を回復できたことから、変異体の責任遺伝子はSH3P1であると必要十分に確認できた。

The investigator screened mutants using ethylnitrosourea as the mutagen, and isolated a mutant that hardly moves even when stimulating with tweezers (hereafter referred to as a mutant) and because this mutation was inherited by Mendelian, it was thought that it was due to a mutation in a single gene, but by actually mapping the responsible genes, squeezing the mutation into a 50kb region on chromosome 6, and克隆和测序该区域的基因，我们在新型基因SH3P1中发现了一个突变。我们发现在SH3P1内含子的剪接受体位点发生了一个突变，从而导致替代剪接和终止密码子的异常，这阻止了正常的SH3P1蛋白合成。这项研究旨在通过阐明SH3P1的功能，并将这一发现应用于人类疾病，以阐明该突变体中运动异常的机制。电生理实验得到了进一步的进展，并进行了实验，其中使用斑块夹方法测量了运动过程中的电位变化。诱导运动的触觉刺激的信号通过感觉神经元→中间神经元（脑）→运动神经元传播到肌肉，并且在正常个体中，众所周知，肌肉中的30 Hz发生在肌肉中的30 Hz，但在类似情况下在突变体中观察到30 Hz的潜在变化，表明在肌肉中存在异常。当实际检查SH3P1 mRNA表达时，在肌肉中发现了强信号。这是肌肉异常的结果。此外，我们尝试生成一种单克隆抗体，该抗体专门识别SH3P1并分析了其定位，但是免疫染色并未揭示出明显的细胞内定位，但是在整个肌细胞中都检测到了信号。在使用反义吗啡的敲低实验中，复制了突变体的表达系统，并在引入正常mRNA的救援实验中恢复了突变体的运动，从而使突变体负责的基因是SH3P1，这使得有可能完全确认。