個体レベルの唾液腺機能解析の為のsiRNAと超音波を応用した遺伝子抑制法の開発

开发使用 siRNA 和超声分析个体水平唾液腺功能的基因抑制方法

基本信息

批准号：
17659589
负责人：
川口充
金额：
$ 2.11万
依托单位：
Tokyo Dental College
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2005
资助国家：
日本
起止时间：
2005 至 2006
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-17659589/
关键词：
siRNA in vivo 超音波導入法唾液腺 rat

项目摘要

本研究では、in vivoでの遺伝子抑制を個別の臓器で行う技術としてsiRNAと超音波導入法の唾液腺への適応技術を開発することを目指している。モデル動物としてオスのウイスター系ラット(7-9週齢)を用いて実験を行った。昨年度は、1)標的遺伝子の検討、対象としての最適な唾液腺の検討、2)蛍光標識siRNAによる導入効率の検討、3)GAPDHに対するsiRNAによる導入効率の検討を行なった。本年度は、4)超音波照射のパラメータの検討および、5)リポフェクション試薬によるラット唾液腺へのsiRNA導入との比較を行なった。結果;4)超音波照射のパラメータの検討。GAPDHに対するsiRNAを耳下腺導管への逆行性挿管から注入し、超音波強度、照射時間、導入試薬濃度などのパラメータを検討した。照射48時間後に腺体を摘出し、qRT-PCR及びウエスタンブロットによりGAPDH発現量の抑制を観察した。最適なパラメータとして、超音波強度:2,0W/cm^2、照射時間=2分Duty比:50%、併用するマイクロバブル濃度:20%であった。優位な抑制を得るには導入試薬濃度として、1耳下腺あたり16μgのsiRNAを要した。発現抑制はmRNAレベルでは、著明であったが蛋白レベルでは、明らかな抑制は観察できなかった。これは、GAPDHたんぱくの量とライフタイムによると思われた。5)リポフェクション試薬によるラット唾液腺へのsiRNA導入との比較。in vitroでのsiRNA導入に汎用されるリポフェクション法のラット唾液腺へのsiRNA導入効率を検討した。しかし、4)と同様量の16μgのsiRNAに対しin vitroで最適な量のリポフェクション試薬を耳下腺に注入し48時間後に摘出してmRNA量をqRT-PCRにより評価したが、有為な抑制は観られなかった。また、リポフェクション試薬の使用では、耳下腺周囲に著明な炎症反応が観察された。現在、in vivoに使用するリポフェクション試薬量の検討を行なっている。これらの実験結果の一部は、薬理学会総会(平成19年3月14-16日)で発表予定である。また現在、論文を作成中である。

这项研究旨在开发用于siRNA和唾液腺超声引入的适应技术，作为在个体器官中进行体内抑制基因抑制的一种技术。该实验是使用雄性鸟孔（7-9周大）作为模型动物进行的。去年，我们研究了1）目标基因，研究了最佳的唾液腺作为靶标，2）使用荧光标记的siRNA的转导效率，以及3）使用siRNA对GAPDH进行转导效率。今年，我们进行了4）检查超声辐射的参数，以及5）使用lipofection试剂将siRNA诱导与大鼠唾液腺进行比较。结果； 4）检查超声辐射的参数。通过逆行插管将GAPDH的siRNA注射到腮腺导管中，并检查了引入的超声强度，辐照时间和浓度等参数。辐照后48小时去除腺体，并通过QRT-PCR和Western印迹观察到GAPDH表达水平的抑制。最佳参数是超声波强度：2,0 W/cm^2，辐照时间：2分钟占空比：50％和用于组合使用的微泡浓度：20％。为了获得上抑制作用，每个腮腺需要16μgsiRNA作为诱导试剂的浓度。表达抑制在mRNA水平上标记，但在蛋白质水平上未观察到明显的抑制。人们认为这是由于GAPDH蛋白质和寿命的量所致。 5）与siRNA一起使用脂肪触发试剂对大鼠唾液腺进行了比较。我们使用LiPofection（一种用于体外siRNA转移的通用方法）研究了siRNA转移到大鼠唾液腺中的效率。然而，在4）中以相似量的16μgsiRNA在体外注入最佳脂肪触发试剂量，并在48小时后去除mRNA的量，并通过QRT-PCR评估了mRNA的量，但未观察到显着的抑制作用。此外，当使用Lipofection试剂时，在腮腺周围观察到明显的炎症反应。目前，我们正在研究体内使用的脂肪触发试剂的量。这些实验结果中的一些将在药理学学会的股东大会上提出（2007年3月14日至16日）。他目前正在写论文。

项目成果

期刊论文数量（7）

专著数量（0）

科研奖励数量（0）

会议论文数量（0）

专利数量（0）

Expression of the mRNA and protein of serine racemase in primary cultures of rat neurons.

大鼠神经元原代培养物中丝氨酸消旋酶 mRNA 和蛋白的表达。

DOI：
发表时间：
2006
期刊：
Eur J Pharmacol. 548・1-3
影响因子：
0
作者：
Yoshikawa M;Nakajima K;Takayasu N;Noda S;Sato Y;Kawaguchi M;Oka T;Kobayashi H;Hashimoto A
通讯作者：
Hashimoto A

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