サーモセンシングタンパク質の立体構造解析と医療への応用

热敏蛋白的三维结构分析及医学应用

基本信息

批准号：
17659012
负责人：
杉山政則
金额：
$ 1.98万
依托单位：
Hiroshima University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2005
资助国家：
日本
起止时间：
2005 至 2006
项目状态：
已结题

项目摘要

放線菌Streptomyces albusが産生するRheAはリプレッサータンパク質であり,熱を感知してその構造を可逆的に変化させるサーモセンシング機能を有する。本研究では,RheAのサーモセンシング機能を構造生物学的に明らかにするとともに,その機能を医療に役立つ分子スイッチの開発へ応用することを目的としている。昨年度,C末端ヒスチジンタグ付きRheAとその特異的なオペレーターDNAとの複合体の結晶化に成功し,複合体結晶のX線回折実験を行ったが,構造解析に十分な回折強度データは得られなかった。そこで,天然型RheAの大腸菌における発現を行い,各種クロマトグラフィーの手法を用いることにより,その精製系を確立することができた。本年度は,天然型RheAを大量に取得後,その結晶化を行った。シッティングドロップ蒸気拡散法により結晶化を行ったが,数百種を超える結晶化条件を検討したにもかかわらず,結晶は生成しなかった。天然型RheAとオペレーターDNAとの複合体の結晶化も試みたが,結晶は生成しなかった。天然型RheAの精製は困難であり,かつ,結晶も生成しない。そこで,精製の容易なヒスチジンタグ付きRheAへ回帰することにした。ただし,C末端ヒスチジンタグ付きRheAとオペレーターDNAとの複合体の結晶化に成功しているが,その結晶は良質のX線回折データを与えない。RheAのC末端領域はDNA結合部位と考えられることから,C末端ヒスチジンタグが良質結晶の生成を妨げている可能性がある。したがって,N末端ヒスチジンタグ付きRheAを用いることにした。現在,N末端ヒスチジンタグ付きRheAの発現系を構築している。

接线细菌产生的趋势是Albus的抗抑郁剂，具有感染功能，可感知热并反向改变其结构。在这项研究中，目的是阐明RHEA在结构生物学中的热效功能，并将其功能应用于对医疗服务有用的分子开关的发展。去年，我们成功地与C末端组氨酸标签及其特定算子DNA之间的rhea结晶，并在结构分析中获得了足够的衍射强度数据。因此，进行了大肠杆菌中天然RHEA的表达，并且可以使用各种色谱方法来建立精炼系统。今年，结晶是在获得大量天然Rhea后进行的。通过坐式滴蒸汽扩散法进行了结晶，但是尽管检查了数百多个结晶条件，但仍未产生晶体。我们还试图在天然RHEA和算子DNA之间结晶络合物，但没有产生晶体。很难纯化自然趋势，并且没有产生晶体。因此，我决定带有简单的纯化组氨酸标签返回Rhea。但是，它在使用C末端组合和操作员DNA的RheA之间取得了成功，但其晶体不给出高质量的X射线转换数据。由于RHEA的C末端区域被认为是DNA的位点，因此C末端组氨酸标签可能会阻碍高质量晶体的产生。因此，我们决定将RHEA与N末端的Histijin标签一起使用。目前，它正在建立一个具有N-期限终端的RHEA表达系统。