SIAH1の肝発癌における関与の解明と肝癌遺伝子治療の可能性に関する研究

阐明SIAH1与肝癌发生的关系及肝癌基因治疗的可能性研究

基本信息

批准号：
16659355
负责人：
長谷川傑
金额：
$ 2.11万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2004
资助国家：
日本
起止时间：
2004 至 2005
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-16659355/
关键词：
SIAH1 β-catenin Apoptosis tumor suppressor gene LOH mutation methylation haplo-insufficiency

项目摘要

前年度の研究で肝細胞癌におけるSIAH1の発現低下の機序として肝細胞癌の臨床検体100例を用いたRT-PCRによるSIAH1の発現、LOH解析、メチレーション解析からhaploinnsufficiencyの可能性が示唆された。次にin vitoroでのSIAH1の機能を解析した。hepatoma cell linesにおいてSIAH1の発現が低下しているHepG2,Huh7,SNU475を用いてCell viability assayを行うと、いずれもAd-SIAH1導入した細胞にviabilityの低下と細胞増殖抑制がおこった。次にflow cytometry、TUNEL assayを行うとAd-LacZと比べAd-SIAH1を導入したCell linesでsub-G1の増加、アポトーシス細胞の増加を認めた。次にSIAH1導入によるWntシグナル伝達系(Wnt系)に及ぼす影響を調べた。TCF4 assayではWnt系に異常の認めたHepG2とSNU475においてWnt系の亢進を認め、Ad-SIAH1を導入すると抑制された。β-カテニンのwestern blottingを行うとAd-SIAH1導入によりwild typeのβ-カテニンは分解されたがHepG2に認められるmutant typeのβ-カテニンは分解されなかった。そこで蛍光免疫染色でβ-カテニンの細胞内局在を検討したらHepG2で核に集積していたβ-カテニンがAd-SIAH1導入により核外に局在が変化した。よってHepatoma cell linesにおいてAd-SIAH1導入によるWnt系への影響はβ-カテニンの細胞内分解と局在変化によりWnt系を抑制している可能性がある。今後SIAH1導入の効果をin vivoにおいても検討する予定である。

去年的研究中，通过RT-PCR、LOH分析和甲基化分析对100例肝细胞癌Ta的SIAH1表达进行了分析，提出了单倍体不足可能是肝细胞癌中SIAH1表达降低的机制。接下来，我们分析了SIAH1的体外功能。当使用降低肝癌细胞系中SIAH1表达的HepG2、Huh7和SNU475进行细胞活力测定时，Ad-SIAH1转染细胞的活力降低并且细胞增殖受到抑制。接下来，进行流式细胞术和TUNEL测定，与Ad-LacZ相比，在引入Ad-SIAH1的细胞系中观察到亚G1细胞和凋亡细胞的增加。接下来，我们研究了SIAH1的引入对Wnt信号转导系统（Wnt系统）的影响。在 TCF4 测定中，在 HepG2 和 SNU475 中观察到 Wnt 系统激活，两者均具有 Wnt 系统异常，并且当引入 Ad-SIAH1 时，这种激活被抑制。 β-连环蛋白的蛋白质印迹显示，野生型β-连环蛋白因Ad-SIAH1的引入而被降解，但在HepG2中观察到的突变型β-连环蛋白没有被降解。因此，当我们使用荧光免疫染色检查β-连环蛋白的细胞内定位时，我们发现HepG2中在细胞核中积累的β-连环蛋白通过Ad-SIAH1的引入而定位于细胞核外。因此，在肝癌细胞系中，Ad-SIAH1的引入对Wnt系统的影响可能通过β-连环蛋白的细胞内降解和定位变化而受到抑制。未来，我们计划检查SIAH1在体内的引入效果。