改変型アデノウイルスベクターを用いたin vivo胎盤毒性評価系の構築

改良腺病毒载体构建体内胎盘毒性评价体系

• 批准号: 16659039
• 负责人: 中西 剛
• 金额: $ 1.79万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2004
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2004 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-16659039/
• 关键词: アデノウイルスベクター; 胎盤; 発生毒性; 内分泌撹乱作用; 種差

本研究では、医薬品等の化学物質の毒性や副作用の標的臓器として胎盤に注目し、いかなる胎盤機能(遺伝子)が変化した場合に、胎児に対してどのような影響が及ぶのかをin vivoで簡便に検討を行うことが可能な評価系の構築を最終目標としている。そこで、化学物質により変動が認められた胎盤中の遺伝子を、胎盤特異的に発現させて胎児への影響を検討するために、胎盤特異的に遺伝子を発現させるシステムの構築を比較的に容易にin vivoでの遺伝子導入が可能なアデノウイルスベクター(Ad)を用いることで行った。齧歯類胎盤のgiant cellに特異的発現するplacental lactogen(PL)IおよびIIのそれぞれ転写開始点から上流-280bpと-2643bpのDNA断片をマウスのゲノムからクローニングし、下流にルシフェラーゼ発現遺伝子を連結してレポーター遺伝子を作成した。これらの遺伝子発現をラット胎盤細胞Rcho-1細胞とマウス繊維芽細胞株であるL929細胞に発現させて比較検討したところ、プロモーター依存的にRcho-1細胞でのみ高い発現を示すことが明らかとなった。Adを用いて胎盤機能修飾モデル動物の作成を行うために、Adの胎盤への遺伝子導入効率について検討を行った。しかし静脈内投与では、野生型のAd(WT-Ad)は、肝臓での発現が顕著に高く、胎盤での発現は肝臓と比較してわずか0.1%程度であったが、この問題を解決するためにウイルスのファイバー部分にRGD配列を持たせた改変型アデノウイルスベクター(RGD-Ad)を用いて検討を行ったところ、胎盤での発現はWT-Adの約100倍に上昇した。これにより胎盤への簡便な遺伝子導入が可能となり、胎盤の遺伝子変動に伴う発生毒性評価を行うことができると考えられる。

在本研究中，我们将胎盘作为药物等化学物质的毒性和副作用的靶器官，进行了体内研究，以便轻松检查胎盘功能（基因）发生变化时对胎儿的影响最终目标是构建一个可以进行未来研究的评估体系。因此，为了以胎盘特异性的方式表达胎盘中已发现的因化学物质而变化的基因并检查对胎儿的影响，我们开发了一种相对简单的系统以胎盘特异性的方式表达基因这是使用允许体内基因转移的腺病毒载体（Ad）进行的。从小鼠基因组中克隆了啮齿动物胎盘巨细胞特异表达的胎盘催乳素（PL）I和II转录起始位点上游-280 bp和-2643 bp的DNA片段，并获得了荧光素酶表达基因下游连接了一个报告基因。当我们比较这些基因在大鼠胎盘细胞Rcho-1细胞和小鼠成纤维细胞系L929细胞中的表达时，我们发现它们仅在Rcho-1细胞中以启动子依赖性方式高表达。为了利用Ad建立胎盘功能修饰模型动物，我们研究了Ad基因导入胎盘的效率。然而，当静脉注射时，野生型Ad（WT-Ad）在肝脏中显着表达，与肝脏相比，在胎盘中的表达仅为约0.1%。因此，我们使用改良的腺病毒载体进行了研究。 （RGD-Ad）在病毒纤维中具有RGD序列，在胎盘中的表达量比WT-Ad高约100倍。这使得可以容易地将基因引入胎盘，并且人们认为可以评估与胎盘中的基因变化相关的发育毒性。