昆虫の脳由来の単一神経分泌細胞からの新規生理活性ペプチドの発見

从昆虫大脑中的单个神经分泌细胞中发现新型生物活性肽

基本信息

批准号：
16658049
负责人：
長沢寛道
金额：
$ 2.3万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2004
资助国家：
日本
起止时间：
2004 至 2005
项目状态：
已结题

项目摘要

昨年度に引き続きカイコの脳から単一神経分泌細胞を分離しようと試みたが、極めて困難であった。そこで、今年度の途中から方針を変えた。すなわち、これまでに見つかっている大部分の脳神経ペプチドがアラタ体に軸索を伸ばし、そこから血液中に分泌することに注目し、アラタ体を新規ペプチドの探索源とすることにした。5齢幼虫6日目のカイコのアラタ体を摘出し、そのまま質量分析(MALDI-TOF-MS)にかけたところ、m/z 1800-2500に再現性よく13本のイオンピークが認められた。また、既知のペプチドであるボンビキシンと思われるピークがm/z 5000-5400に複数認められた。このことから、アラタ体は神経血液器官として多くの神経ペプチドの貯蔵器官になっていることが確かめられ、当初考えていた方法とは異なるが、本研究の目的である新規神経ペプチドを探索・発見するための方法になりうるものと判断した。そこで、カイコ150個体から、アラタ体を300個集め、60%アセトニトリル/0.1%トリフルオロ酢酸で抽出し、逆相HPLCで分離・分取した。一定時間ごとに分取した5つの連続する画分について質量分析を行った結果、分画前に観察された13本のピークに相当するピークが混合物としてではあるが、そのうち12本が5つの画分に回収されていることがわかった。m/z 2371に観察されたペプチドについてアミノ酸配列解析に供したが、おそらく量が少ないために明確な配列結果を得ることは出来なかった。現在、スケールアップして精製しているところであり、この方法で必ず新規ペプチドが得られるものと確信している。

继去年之后，我们尝试从蚕脑中分离出单个神经分泌细胞，但难度极大。因此，我们在今年中途改变了政策。也就是说，我们关注的是迄今为止发现的大多数大脑神经肽的轴突都延伸到了阿拉塔的身体，并从那里分泌到血液中，并决定将阿拉塔的身体作为新肽的搜索源。当取出5龄幼虫和6日龄蚕翼体直接进行质谱分析（MALDI-TOF-MS）时，在m/z 1800-2500处观察到13个离子峰，重现性良好。此外，在 m/z 5000-5400 处观察到多个峰，据信是已知的肽蟾蜍素。由此确认，阿拉塔体是一个储存有多种神经肽的神经血液器官，虽然这种方法与最初想象的不同，但这项研究的目的是探索和发现新的神经肽。可能是这样做的一种方法。因此，从150只蚕个体中收集300个翼体，用60％乙腈/0.1％三氟乙酸提取，并通过反相HPLC分离和分级。对每隔一定时间连续采集的5个级分进行质谱分析，结果发现与分级前观察到的13个峰对应的12个峰以混合物的形式出现，但其中的12个峰是在5分钟内收集到的。。对m/z 2371处观察到的肽进行氨基酸序列分析，但无法获得明确的序列结果，可能是由于量太少。我们目前正在放大和纯化肽，并且有信心使用这种方法能够获得新的肽。