感温性ゼラチンを細胞外マトリックスに用いた生体内での三次元的心筋組織構築の試み

尝试以热敏明胶作为细胞外基质在体内构建三维心肌组织

基本信息

批准号：
15659329
负责人：
妙中義之
金额：
$ 1.98万
依托单位：
National Cardiovascular Center Research Institute
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至 2005
项目状态：
已结题

项目摘要

前年度までの研究で,感温硬化性ゼラチンであるポリN-イソプロピルアクリルアミドグラフト化ゼラチン(以下,ゼラチン)を細胞外マトリックスとして用いることによりラット胎仔心筋細胞を培養して60μmの厚さのある三次元的な心筋組織が得られることが分かった。本年度は,更に臨床応用の可能性を探るために,ラット胎仔心筋細胞の代わりに骨髄間葉系幹細胞を用いて三次元的な組織構築が可能であるかを検討した.成ヤギ腸骨より骨髄を採取し,間葉系幹細胞を含む付着系の細胞を単離したうえで,ラット胎仔心筋の場合と同様に,5x10^7 cells/mLの濃度で,50 mg/mLのゼラチンと混合し,ヒアルロン酸を3 mg/mL加えて培養を試みた.通常の細胞および蛍光標識した細胞を培養して観察したが,細胞が生存している際に見られる,紡錐形の細胞は見られず,培養できなかったと判断した.培養に適切な濃度が胎仔心筋と異なる可能性があるため,細胞の濃度を1x10^7 cells/mLから10x10^7 cells/mLまで変化させて,更にゼラチンの濃度を50 mg/mLから200 mg/mLまで変化させたが,成長する細胞を認めなかった.培地の厚さも培養に影響するといわれているため,ゼラチンの厚さを200μmから600μmの間で変化させたが,紡錐形の細胞を認めなかった.付着系の細胞を培養する際には,他の細胞と接し,かつ増殖する余地のある適切な濃度が重要であるといわれており,胎仔心筋より増殖しやすい間葉系幹細胞を培養するためには,今回の検討の範囲よりも更に細胞濃度を低くする必要があったのではないかと考える.また,今回の実験では,ゼラチンの厚さが200μmまでを検討したが,培地の厚さが厚いと培養に不利に働くといわれているため,今後はより薄いゼラチンで検討すべきであると思われた.また,骨髄間葉系細胞に培養皿上である程度心筋への分化誘導をかけてからゼラチンと混合することも重要ではないかと考えられた.

直到上一年的研究表明，使用多根 - 异丙基丙烯酰胺移植的明胶（以下称为明胶），一种热敏感明胶，作为细胞外基质，可以培养大鼠胎儿心肌细胞，以获得三维的心肌组织，并具有三维的心肌组织。在今年，为了进一步探索临床应用的可能性，我们研究了骨髓间充质干细胞是否可用于使用骨髓间充质干细胞而不是大鼠胎儿心肌细胞来构建三维组织。从成年山羊iLiac，含有间质干细胞的孤立的粘附细胞中收集骨髓，就像胎儿大鼠胎儿心肌一样，在5x10^7细胞/ml的浓度下与50 mg/ml明胶混合，并添加3 mg/ml的透明质酸到培养中。尽管培养了正常细胞和荧光标记的细胞，但我们确定当细胞活着并且无法培养时未发现自旋形细胞。由于适当的培养浓度可能与胎儿心肌的浓度不同，因此细胞的浓度为1x10^7细胞/ml至10x10^7细胞/ml。将明胶的浓度从50 mg/ml更改为200，尽管细胞被更改为mg/ml，但未观察到生长的细胞。培养基的厚度也被认为会影响培养物，因此明胶的厚度在200μm和600μm之间更改，但未观察到自旋形细胞。培养粘附细胞时，据说与其他细胞接触并具有生长空间的适当浓度很重要，并且为了培养比胎儿心肌更加增殖的间充质干细胞，进行了这项测试。我认为有必要降低细胞浓度甚至低于治疗范围。在这项实验中，我们还研究了明胶的厚度高达200μm，但据说中等厚度将对培养物构成劣势，因此人们认为将来应该考虑使用较薄的明胶。人们还认为，在将其与明胶混合之前，将分化为培养皿中的心肌很重要。