アンチセンス法を用いた絨毛癌の遺伝子治療に関する基礎的研究

反义基因治疗绒毛膜癌的基础研究

基本信息

批准号：
12770913
负责人：
佐藤朝臣
金额：
$ 1.34万
依托单位：
Kobe University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至 2001
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-12770913/
关键词：
絨毛癌ヒト絨毛性ゴナドトロピン遺伝子治療

项目摘要

絨毛癌細胞はhCGを過剰に分泌しており、一方で細胞表面にはhCG受容体が発現していることから、過剰に産生されるhCGを介したautocrine/paracrine機構と腫瘍の自己増殖機構との関連性が示唆される。そこで本研究では絨毛癌細胞において、hCGのβサブユニツト産生をアンチセンス法にて抑制することで,hCGをシグナルとしたautocrine/paracrine機構を阻害し絨毛癌細胞の増殖を抑制することを試みた。まずRT-PCR法によりhCGβcDNAを作成した。この遺伝子断片を3'-5'方向に転写されるように発現ベクターpcDNA3.1に挿入し,プラスミドpcDNA3.1 rCGβを作成,絨毛癌細胞株JArに形質導入した(reverse transfection)。geneticin耐性をselection markerとしてクローン化を行ったところ,hCGβ発現量の異なる種々のクローンが得られ,本手法によりhCGβ発現が抑制されることが示された。次に各クローン毎に,PCNA発現を指標として細胞増殖能を,TUNEL法を指標としてアポトーシス誘導能について検討行った。遺伝子導入によりhCGβ発現の低下したクローンにおいては,遺伝子未導入のJArあるいはpcDNA3.1のみ導入したJAr(rCGβ非導入)と比較してPCNA発現が低下し,TUNELを指標としたアポトーシス発現が高まることが示された。さらに,MTT法により培養経過中の生存細胞数の推移について検討すると,hCGβ発現の低下したクローンにおいては,培養開始後4日以降,遺伝子非導入のJArあるいはpcDNA3.1のみ導入したJAr(rCGβ非導入)と比較し生存細胞数は有意に減少した。以上の結果より,絨毛癌細胞株JArにおいて,hCGβ発現が細胞の増殖,アポトーシスに密接に関与している可能性が示唆された。

绒毛膜瘤细胞分泌过度HCG，而HCG受体在细胞表面表达，这表明HCG介导的自身分泌/旁分泌机制的过量产生与肿瘤自动增强机制之间存在关系。因此，在这项研究中，我们试图通过使用反义抑制HCG细胞中HCG的β亚基的产生来抑制脉络膜癌细胞的产生，从而使用HCG抑制HCG作为信号作为信号，并抑制梭形细胞的扩散。首先，通过RT-PCR制备HCGβcDNA。将该基因片段插入表达载体pcDNA3.1中，以便沿3'-5'方向转录，并生成质粒pcDNA3.1rcgβ并转化为绒毛膜癌细胞系罐。当将遗传毒素抗性作为选择标记时，获得了不同HCGβ表达水平的各种克隆，并表明目前的技术抑制了HCGβ表达。接下来，对于每个克隆，使用PCNA表达作为指标研究了细胞增殖能力，并使用TUNEL方法作为指标检查了凋亡诱导能力。结果表明，在基因转移引起的HCGβ表达降低的克隆中，与没有基因转移或仅引入PCDNA3.1的JAR相比，PCNA表达降低了（非RCGβ）（非RCGβ），并且使用TUNEL用作指示器的凋亡表达增加了。此外，在使用MTT方法检查培养过程中可行细胞数量的变化时，在HCGβ表达降低的克隆中，与未转导的JAR或PCDNA3.1相比，可行细胞的数量显着减少，仅在培养后4天后引入（非转移）。以上结果表明，HCGβ表达可能与脉络膜癌细胞系罐中细胞增殖和凋亡密切相关。