カリウムチャンネル遮断薬による心筋Ca^<2+>依存性シグナルの活性化

钾通道阻滞剂激活心肌Ca^2+依赖性信号

• 批准号: 12770352
• 负责人: 田原 聰子
• 金额: $ 0.7万
• 依托单位: Keio University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 2000
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2000 至 2001
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-12770352/
• 关键词: 4-aminopyridine; K channel blocker; ERK; EGFR

本研究ではK+チャンネル遮断薬の使用と心筋Ca2+依存性シグナルならびにERKの活性化の関係を明らかにした。ラットの新生児培養心筋細胞に対し、以下の実験を行った。1.K+チャンネル遮断薬4-aminopyridine(4-AP)投与による活動電位の測定及び蛍光色素による[Ca2+]-transient測°定を行い、活動電位持続時間の延長と心筋細胞内Ca2+濃度の増加を認めた。2.K+チャンネル遮断薬投与によるERKの活性化培養液中にK+チャンネル遮断薬(4-AP、TEA、Quinidine、E-4031)を添加し、抗リン酸化ERK抗体を用いてWestern blotを行ったところ、全ての薬剤にてERKの活性化が認められた。3.心筋細胞のERK活性化にいたる経路を解明するため、細胞内Ca2+シグナル伝達経路の特異的阻害薬を培養心筋細胞に前投与し、4-APによるERKリン酸化を検討した。Ca2+キレート剤(EDTA、BAPTA-AM)、L型Ca2+チャンネル遮断薬(diltiazem)、EGFR遮断薬(AG1478)、Pyk2阻害薬(cytochalasinD)では抑制され、PKC阻害薬(chelerythrine)、CaMK II阻害薬(KN92)、CaM阻害薬(calmiddazolium)では抑制されなかった。4.4-AP刺激によるEGFR、Pyk2の活性化を免疫沈降Western法にて検討し、EGFR、Pyk2のチロシンリン酸化を認めた。またEGFRのdominant-negative mutantを用いて、in vitro kinase assayを行ったところ、4-APによるERK活性はほぼ完全に抑えられた。Kチャンネル遮断薬は細胞内Ca2+の増加によりPyk2、EGFRを介してERKを活性化した。

在本研究中，我们阐明了 K+ 通道阻滞剂的使用与心肌 Ca2+ 依赖性信号和 ERK 激活之间的关系。以下实验是在培养的新生大鼠心肌细胞上进行的。 1.通过施用K+通道阻滞剂4-氨基吡啶(4-AP)来测量动作电位，并使用荧光染料测量[Ca2+]-瞬态，以延长动作电位持续时间并增加心内Ca2+浓度。我承认。 2.通过给予K+通道阻滞剂来激活ERK 将K+通道阻滞剂(4-AP、TEA、奎尼丁、E-4031)添加到培养基中，并使用抗磷酸化ERK抗体进行Western印迹，但是，激活了ERK。所有药物均观察到 ERK。 3.为了阐明心肌细胞中ERK激活的途径，我们将细胞内Ca2+信号通路的特异性抑制剂预先给予培养的心肌细胞，并通过4-AP检测ERK磷酸化。它被Ca2+螯合剂（EDTA、BAPTA-AM）、L型Ca2+通道阻滞剂（地尔硫卓）、EGFR阻滞剂（AG1478）和Pyk2抑制剂（细胞松弛素D）以及PKC抑制剂（白屈菜红碱）和CaMK II抑制剂（KN92）抑制）和 CaM 抑制剂（卡咪达唑）并不能抑制它。采用Western免疫沉淀法检测4.4-AP刺激对EGFR和Pyk2的激活作用，观察EGFR和Pyk2的酪氨酸磷酸化情况。此外，当使用 EGFR 显性失活突变体进行体外激酶测定时，4-AP 测定的 ERK 活性几乎完全被抑制。 K 通道阻滞剂通过增加细胞内 Ca2+，通过 Pyk2 和 EGFR 激活 ERK。

项目成果

Tahara S et al.: "Potassium channel blocker activates extracellular signal-regulated kinases through Pyk2 and epidermal growth factor receptor in rat cardiomyocytes"Journal of the American College of Cardiology. 38-5. 1554-63 (2001)

Tahara S 等人：“钾通道阻滞剂通过大鼠心肌细胞中的 Pyk2 和表皮生长因子受体激活细胞外信号调节激酶”美国心脏病学会杂志。