新規因子sproutinの神経ネットワーク賦活化と痴呆の改善に及ぼす作用

新因子sproutin对神经网络激活和痴呆改善的影响

基本信息

批准号：
11780557
负责人：
東田千尋
金额：
$ 1.41万
依托单位：
Toyama Medical and Pharmaceutical University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1999
资助国家：
日本
起止时间：
1999 至 2000
项目状态：
已结题

项目摘要

【本研究は、神経突起伸展因子としてラットおよびマウスから単離したsproutinの、神経ネットワーク構築に及ぼす作用を明らかにするために、1.sproutinによるシナプス形成作用を脳スライス培養標本や初代培養神経細胞を用いて調べる、2.マウス脳内におけるsproutinの機能を、sproutin発現のノックダウン法で調べる、3.ヒトのsproutin配列を同定する、ことを目的とした。】1、幼若ラットの大脳皮質をスライス標本として培養し、また胎児ラットの大脳皮質の神経細胞を初代培養した。これらの標本へsproutin cDNAをトランスフェクトすることを目的としたが、まずその前段階として、GFP(Green Fluorescent Protein)発現ベクターに挿入したsproutin cDNAを、株化神経細胞SK-N-SHにトランスフェクトした。しかし、GFPの発色でモニタリングされるべきsproutinの発現が観察されなかったことから、現在トランスフェクトの条件や構築したベクターの確認を進行中である。2.Sproutin配列の2ヵ所に対するantisense oligomerを合成した。ddYマウスの脳室内に、10μgで単回投与あるいは3日間連続投与し24時間後、大脳皮質と海馬を摘出した。いずれの部位でもantisense oligomer投与によるsproutin mRNA発現の減少が認められなかったことから、ノックダウンに至適なantisense oligomerの配列を検討中である。3.ヒトのsproutin cDNA配列を解析するために、既に配列を決定したマウスおよびラットのsproutin配列を参考にした、(RT-)PCRによるクローニングを行なった。プライマー配列や増幅条件を複数の組み合わせで用意し、ヒト全脳のcDNAライブラリーやヒト神経芽細胞種SK-N-SHのtotal RNAからクローニングを試みたが、いずれも増幅産物が得られなかった。このことは、ヒトのsproutin配列がマウスやラットの配列とかなり異なっていることを示唆している。

[本研究旨在阐明从大鼠和小鼠中分离的芽孢蛋白作为神经突生长因子对神经网络构建的影响2。使用芽孢蛋白表达的敲低方法研究芽孢蛋白在小鼠大脑中的功能；识别人类发芽蛋白序列。】 1、幼鼠大脑皮层切片标本培养，胎鼠大脑皮层神经元原代培养。目的是将芽芽蛋白 cDNA 转染到这些样本中，但作为初步步骤，将插入 GFP（绿色荧光蛋白）表达载体的芽芽蛋白 cDNA 转染到神经元细胞系 SK-N-SH 中。然而，由于没有观察到应该通过GFP显色来监测的sproutin的表达，因此我们目前正在确认转染条件和构建的载体。 2.针对Sproutin序列中的两个位点合成反义寡聚物。单剂量10μg注入ddY小鼠心室，或连续给药3天，24小时后摘除大脑皮层和海马。由于在任何位点施用反义寡聚物均未观察到芽芽蛋白 mRNA 表达的减少，因此我们目前正在研究用于敲除的最佳反义寡聚物序列。 3.为了分析人芽芽蛋白cDNA序列，使用先前测序的小鼠和大鼠芽芽蛋白序列作为参考，通过(RT-)PCR进行克隆。我们准备了多种引物序列和扩增条件的组合，并尝试从人全脑cDNA文库和人神经母细胞瘤细胞型SK-N-SH总RNA中进行克隆，但在这两种情况下均未获得扩增产物。这表明人类的发芽蛋白序列与小鼠和大鼠的有很大不同。