Fプラズミド分配遺伝子産物SopA・SopBとDNAの高次複合体の構造生物学

F质粒分布基因产物SopA/SopB与DNA高阶复合物的结构生物学

• 批准号: 11780478
• 负责人: 花井 亮
• 金额: $ 1.41万
• 依托单位: Rikkyo University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1999
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1999 至 2000
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-11780478/
• 关键词: Fプラズミド; 染色体分配; 構造生物学; 電子顕微鏡; サイレンシング; フットプリンティング

今年度の研究成果は次の通りであった。(1)sopB変異体の解析-サイレンシングを起こさないsopBの変異体の解析を終了した。9つの新たな変異体のうちサイレンシングを全く起こさないものは、L92P変異体のみであった。この変異体は認識配列DNAに結合するにもかかわらず、野生型と異なり結合部位近傍の遺伝子のサイレンシングを起こさず、また、Fプラズミドの分配においても機能が低下していた。GFPとの融合タンパクは、野生型が細胞の中程に局在するのに対して、この変異体は細胞全体に一様に分布していた。この結果、サイレンシングはSopBタンパク質が局所的に高濃度で存在するために、結合部位近傍のDNAにも非特異的に結合することで引き起こされると結論した。(2)SopAタンパク質の構造の解析-タンパク質のフットプリントをSopAについて行った。その結果、この分子は2つのドメインからなることと、SopBとの相互作用によりSopAの中程のプロテアーゼ感受性が低下することがわかった。(3)SopA-SopB-DNA複合体の解析-SopAのDNA結合についてフィルターバインディング実験を行ったところ、ADP結合によってDNA結合が引き起こされるが、結合が配列非特異的であることがわかった。結合が配列非特異的であることは電子顕微鏡観察によっても明らかであった。さらにSopBが存在するときの電子顕微鏡像においてはDNAのcontourは非常に複雑になり、SopAとSopBがDNAに結合しながら相互作用することによって高次の複合体が形成されることが明らかになった。

今年的研究结果如下。 （1）SOPB变体的分析 - 未引起沉默的SOPB变体的分析已终止。仅有的九种新品种根本没有引起沉默。尽管与野生型不同，尽管与野生型不同，但与野生型不同，该函数在F-质类似的分布中降低。在带有GFP的融合蛋白中，野生型位于细胞中间，而该变体均匀地分布在整个细胞中。结果，我们得出的结论是，由于SOPB蛋白在高浓度下存在，因此沉默是由与连接位点附近DNA的非特异性结合引起的。 （2）对SOPA蛋白 - 蛋白质足迹的结构进行分析。结果，发现分子由两个域组成，与SOPB的相互作用降低了SOPA中的蛋白酶敏感性。 （3）对SOPA-SOPB-DNA复合体SOPA DNA键实验的分析表明，DNA键是由ADP键引起的，但发现该结合是非特异性的。通过电子显微镜观察，结合是非特异性的事实。此外，在存在SOPB的电子显微镜图像中，DNA的轮廓变得非常复杂，很明显，在与DNA结合时形成了较高的阶络合物。

项目成果

N,Hotoda & R,Harai: "Characterization of Recombinant Human DNA topoisowerase IVαActivity Expressed in Yeast."J.Biochem.. 127. 1109-1113 (2000)

N,Hotoda & R,Harai：“酵母中表达的重组人 DNA 拓扑异构酶 IVα 活性的表征。”J.Biochem.. 127. 1109-1113 (2000)