線虫における液胞型ATPaseの役割とクロライドイオンによる調節

液泡 ATP 酶在秀丽隐杆线虫中的作用及氯离子的调节

基本信息

批准号：
11780445
负责人：
岡敏彦
金额：
$ 1.41万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1999
资助国家：
日本
起止时间：
1999 至 2000
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-11780445/
关键词：
液胞型ATPase クロライドイオン

项目摘要

本年度の研究行なった。具体的には以下の示す。1)新たな線虫V-ATPase遺伝子の同定本研究では、V-ATPaseの作り出す多様な酸性環境の役割を明らかにするために、複数存在するV-ATPaseサブユニットのアイソフォームに着目し、アイソフォームが酸性環境の多様性にどう影響しているかを理解しようとしている。そのために、線虫でアイソフォーム遺伝子の欠損変異体の作成、解析を行い、その構築している酸性環境を同定することを目指している。そのために、線虫のデータベースより、V-ATPaseサブユニットaに似たESTクローンを検索し、4種類のクローンを同定した。ESTクローンと5'-RACE法で得られたPCR産物の塩基配列を決定し、全長のcDNAの配列を明らかにした。これかV-ATPaseサブユニットaイソフォーム遺伝子(vha-5,vha-6,vha-7,unc-32)は、それぞれ873,865,966,894アミノ酸残基より成るタンパク質をコードしていた。2)線虫V-ATPase変異体の構築平成12年度は、新らたに同定したV-ATPaseサブユニット遺伝子)の欠損変異体の構築を目指した。まず2本鎖RNA(dsRNA)を用いたRNA interference法により一時的にvha遺伝子の発現を遮断し、目的とする欠損変異体の表現型を解析した。vha-5遺伝子のdsRNAを成虫に導入することにより、その子孫が2令幼虫期で死滅したことから、vha-5遺伝子が線虫の3令幼虫への発生に重要な役割を担っていることが示唆された。また、vha-6やunc-32遺伝子のdsRNAを導入すると、1令幼虫や胚の段階で発生が押さえられ死滅することが分かった。vha-7遺伝子のdsRNA導入では子孫に何の変化も見られなかった。これら原因としては、それぞれの発生段階で特異的なサブユニット構成のV-ATPaseの活性が必要とされていることが推定される。現在は、これら遺伝子の機能欠損による致死の原因を分子レベルで検討中である。

今年进行了研究。具体如下所示。 1）新秀丽隐杆线虫V-ATPase基因的鉴定在本研究中，为了阐明V-ATPase所产生的各种酸性环境的作用，我们重点研究了多个V-ATPase亚基的异构体并鉴定了异构体。我们正在尝试了解泡沫如何影响酸性环境的多样性。为此，我们的目标是创建和分析线虫同种型基因的缺失突变体，并鉴定它们所产生的酸性环境。为此，我们在秀丽隐杆线虫数据库中搜索了与V-ATPase亚基a相似的EST克隆，并鉴定了四种类型的克隆。测定EST克隆的核苷酸序列和5'-RACE法获得的PCR产物，并揭示全长cDNA序列。 V-ATP酶亚基a同种型基因（vha-5、vha-6、vha-7、unc-32）编码分别由873、865、966和894个氨基酸残基组成的蛋白质。 2) 线虫V-ATPase突变体的构建2000年，我们旨在构建新鉴定的V-ATPase亚基基因的缺失突变体。首先，我们使用双链RNA（dsRNA）通过RNA干扰方法暂时阻断vha基因的表达，并分析所需缺失突变体的表型。通过将vha-5基因的dsRNA导入成虫中，子代在二龄幼虫阶段死亡，表明vha-5基因在线虫三龄幼虫的发育中发挥重要作用。此外，还发现当引入vha-6或unc-32基因的dsRNA时，一龄幼虫和胚胎阶段的发育受到抑制，导致死亡。在引入 vha-7 基因的 dsRNA 后，在后代中没有观察到任何变化。据推测，其原因是每个发育阶段都需要具有特定亚基组成的V-ATP酶的活性。我们目前正在分子水平上研究这些基因功能缺陷导致的致死原因。