株化細胞の分化過程に対する内分泌攪乱物質の影響評価法の開発

开发一种评估内分泌干扰物对已建立细胞系分化过程的影响的方法

• 批准号: 11780395
• 负责人: 吉見 立也
• 金额: $ 1.34万
• 依托单位: Tokyo University of Pharmacy and Life Science
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1999
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1999 至 2000
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-11780395/
• 关键词: 肺; 分化; 内分泌攪乱化学物質; M3E3; C3; エストロゲンレセプター; HNF3; サーファクタント; クララ細胞; 内分泌撹乱化学物質; C3 cell; エストラジオール; Sp-B; CCSP

1.M3E3/C3細胞の変化の検出【all-transレチノール添加】 細胞を、レチノールを加えた条件において分化誘導培養を行い、肺の分化マーカーであるサーファクタント蛋白Sp-BとSp-C、及びCCSP(クララ細胞特異的分泌タンパク質)、HNF3α(肝細胞核因子)についてmRNAの発現変化を定量PCRによって検出する系を確立した。細胞は肺のクララ細胞様の分化形質を示すことがわかった。【hypoxia条件】 hypoxia条件において分化誘導培養を行い、神経内分泌細胞の分化マーカーであるクロモグラニンAについて発現変化をPCRによって検出する系を確立した。この結果、細胞は肺のNeuroendocrine細胞様の分化形質を示すことが示唆された。2.ホルモン様物質の暴露による影響上記の細胞分化系にエストラジオールを添加すると、Sp-B、及びCCSPの発現が減少したが、Sp-Cについては増加した。また、クロモグラニンAの発現はエストラジオールにより減少することがわかった。3.調節因子の解析ホルモン様物質が分化の更に上流に与える影響を探るために、肺における転写調節を行っている因子(HNF3α、TTF-1)について、PCRにより検出したところ、細胞分化に伴い発現は増加した。4.エストロゲンレセプターの発現解析ER-αについてはM3E3/C3細胞サンプルにおいて発現が検出されたが、エストラジオール添加による影響はみられなかった。β型レセプターの検出を試みたが発現量が少なく検出が困難であった。5.エストロゲンの影響の解析エストラジオールの影響は、この細胞の分化因子の発現に対して抑制的であることが示唆された。その影響を分子レベルで解析する為に、ホメオボックス領域に特異的なprimerを設計し、3'-RACE法を用いて検出を試みたところ、HoxA5について、発現が抑制される傾向が示された。

1. Detection of changes in M3E3/C3 cells [All-trans retinol addition] Cells were cultured inducing differentiation under conditions with retinol added, and a system was established to detect changes in mRNA expression for the surfactant proteins Sp-B and Sp-C, CCSP (Clara cell-specific secreted protein), and HNF3α (hepatocellular nuclear factor) by quantitative PCR.发现细胞表现出肺的克拉拉样特征。 [缺氧条件]在低氧条件下进行了诱导分化的培养物，并建立了一个系统来检测PCR通过神经内分泌细胞分化的标志性铬烷蛋白A的表达变化。这表明细胞在肺中表现出分化的特征，例如神经内分泌细胞。 2。在上述细胞分化系统中添加雌二醇的激素样物质的影响降低了SP-B和CCSP的表达，但对于SP-C而增加。还发现雌二醇降低了铬烷蛋白A的表达。 3。分析调节因素以研究激素样物质对分化上游的影响，当检测到调节肺中转录（HNF3α，TTF-1）的因子被PCR检测到，该表达随细胞分化而增加。 4。雌激素受体的表达分析：在M3E3/C3细胞样品中检测到ER-α的表达，但从添加雌二醇中没有观察到影响。我们试图检测β型受体，但表达水平很小，并且很难检测。 5。雌激素作用的分析建议雌二醇的作用是对该细胞中分化因子表达的表达的抑制作用。为了分析分子水平上的效果，设计了特定于同型毒素区域的引物，并使用3'-race方法尝试了检测，HOXA5显示出抑制表达的趋势。

项目成果

N.Nakamura,T.Yoshimi et al.: "Analysis of Hox-related genes involved in the lung epithelial cell development"Cell Structure and Function. 24・6. 666 (1999)

N. Nakamura、T. Yoshimi 等：“参与肺上皮细胞发育的 Hox 相关基因的分析”细胞结构和功能 24・666（1999）。

T.Yoshimi,Y.Takahashi et al.: "Changes in lung-specific molecular expression during differentiation of hamster embryonic M3E3/C3 cell line."Biochemistry and Cell Biology. 78・6. 659-666 (2000)

T. Yoshimi、Y. Takahashi 等人：“仓鼠胚胎 M3E3/C3 细胞系分化过程中肺特异性分子表达的变化”。生物化学和细胞生物学 78・6 (2000)。

S.Shimada,T.Yoshimi et al.: "CCSP promoter based GFP expression in the course of lung epithelial cell differentiation."Cell Structure and Function. 25・6(in press). (2000)

S. Shimada、T. Yoshimi 等人：“肺上皮细胞分化过程中基于 CCSP 启动子的 GFP 表达”。细胞结构和功能（2000 年出版）。

T.Yoshimi,Y.Takahashi et al.: "Studies on lung epithelial cell differentiation using in vitro culture system"Cell Structure and Function. 24・6. 666 (1999)

T. Yoshimi、Y. Takahashi 等：“利用体外培养系统进行肺上皮细胞分化的研究”《细胞结构与功能》24・6（1999）。

N.Nakamura,T.Yoshimi et al.: "Analysis of Hox-related genes involved in the lung epithelial cell development."Cell Structure and Function. 24・6. 666 (1999)

N. Nakamura、T. Yoshimi 等：“参与肺上皮细胞发育的 Hox 相关基因的分析。”24·6（1999）。