ウエルシュ菌エンテロトキシン受容体の膜孔形成機構の解析

产气荚膜梭菌肠毒素受体膜孔形成机制分析

• 批准号: 11770140
• 负责人: 片平 じゅん
• 金额: $ 1.41万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1999
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1999 至 2000
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-11770140/
• 关键词: 膜孔形成性細菌毒素; 受容体; 食中毒; トポロジー

1.CPE結合部位の同定前年度に明らかにしたCPE受容体の2番目の細胞外領域が、毒素感受性に必須であるという知見に基づき、同領域とグルタチオンSトランスフェラーゼの組換え融合タンパクを発現・精製し、CPEをプローブとして用いたリガンドブロット法を行なった.その結果、この領域にCPEが直接結合することを明らかにできた.スキャッチャード・プロットの解析から、同領域とCPEとの結合の親和性は、1.0×10^8M^<-1>とCPE受容体発現細胞に対する結合親和性とほぼ等しいことを明らかにした.したがって、CPE受容体の2番目の細胞外領域が、CPEの結合部位として機能すると結論付けた.2.CPE受容体の大量発現系の確立CPE受容体のバキュロウイルスでの大量発現系を確立した.培養液1Lあたり約0.1mgのCPEが得られた.現在、CPEの膜孔形成機構をさらに詳細に解析するために、精製CPE受容体をリポソーム中に再構築し、無細胞系でのCPEの機能アッセイの確立を試みている.

1。基于以下发现，即在上一年揭示的CPE受体的第二个细胞外区域对于毒素敏感性至关重要，我们表达并纯化了同一区域的重组融合蛋白和谷胱甘肽S转移酶的重组融合蛋白，并使用cpe as a Probe进行了ligand blotting方法。结果，有可能揭示CPE直接与该区域结合。从SCATCHARD图的分析中，同一区域和CPE之间结合的亲和力为1.0×10^8M^<-1>和CPE受体。发现它大约等于当前细胞的结合亲和力。因此，它得出结论，CPE受体的第二个细胞外区域充当CPE.2的结合位点。建立用于CPE受体的高体积表达系统，我们建立了用于杆状病毒中CPE受体的高体积表达系统。每个L培养基可获得约0.1 mg的CPE。为了进一步分析CPE孔形成的机制，我们正在尝试将纯化的CPE受体重建为脂质体，并在无细胞系统中建立CPE的功能性测定。

项目成果

Fujita,K.,Katahira,J., et al.: "Clostridium perfringens enterotoxin binds to the second extracellular loop of Claudin-3, a tight juncition integral membrane protein"FEBS Letters. 476. 258-261 (2000)

Fujita,K.、Katahira,J. 等人：“产气荚膜梭菌肠毒素与 Claudin-3（一种紧密连接整合膜蛋白）的第二个细胞外环结合”FEBS Letters。