Na^+/Ca^<2+>交換機構(NCX)遺伝子を発現させた細胞におけるNCX電流の検討

表达Na^+/Ca^<2+>交换机制(NCX)基因的细胞中NCX电流的检查

• 批准号: 11770047
• 负责人: 綿野 智一
• 金额: $ 1.34万
• 依托单位: Fukushima Medical University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1998
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1998 至 1999
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-11770047/
• 关键词: NCX1遺伝子; Ca^<2+>; Ca^<2+>イオノフォア; NCX電流; CD-8

心室筋では,細胞内に高濃度のCa^<2+>を負荷すると強縮するため,NCX電流に対する細胞内Ca^<2+>濃度の影響の詳細な検討は難しい.継代培養可能で,かつ細胞内Ca^<2+>濃度を高くしても強縮しない細胞に,心筋型NCX遺伝子(NCX1)をトランスフェクトして安定発現株をクローン化し,簡便に心筋型NCX電流を測定できる系を確立するため以下の実験を行った.昨年度はNCX1のcDNAを作成,発現ベクター(pcDNA3)にサブクローニングし,各種細胞にリポフェクション法で発現した.何割かの細胞に発現していることはRT-PCRにより確認したが,発現した細胞を選別できなかった.(1)NCX1を過剰発現した細胞の選別;NCX1が過剰発現した細胞は,細胞内にCa^<2+>を負荷してもNCX1が上昇した細胞内Ca^<2+>を排出するため細胞死を起こさないことが知られている.このことを利用してNCX1が過剰発現した細胞細胞のみを選別するために,細胞の培地中にCa^<2+>イオノフォアA-23187あるいはイオノマイシンを加えて培養を試みた.Ca^<2+>イオノフォアの濃度を検討したが選別できなかった.(2)CD-8を発現させると金属のビーズを細胞のまわりにつけるために,可視的に発現細胞を見分けることができる.現在,CD-8とNCX1を共発現させる手法を検討中である.発現させるCD-8とNCX-1のcDNAの量とその比率時間などの検討を行なっている.共発現ができた後細胞に金属のビーズをまき,ビーズのついた細胞を指標にNCX1発現細胞と考え,NCX電流の測定を行う予定である.

在心室肌肉中，细胞内Ca^<2+>浓度对NCX电流的影响很难进行详细研究，因为高浓度的Ca^<2+>适用于可以亚培养的细胞，即使Ca^<2+>的浓度也增加了，并且即使浓度增加了，并且稳定的表达应变也是稳定的nc nc ycx ycx，即NCX1 cDNA于去年创建，亚克隆到表达载体（PCDNA3）中，并使用LiPofection在各种细胞中表达。尽管已确认它是通过RT-PCR在一定比例的细胞中表达的，但不可能整理出表达的细胞。 （1）选择过表达NCX1的细胞；过表达NCX1的细胞可以在细胞内加载。众所周知，没有发生细胞死亡，因为它排出了升高的细胞内Ca^<2+> Ca^<2+>离子粒子A-23187或离子霉素被添加到细胞培养基中，以选择仅选择NCX1过表达的细胞细胞。研究了Ca^<2+>离子载体的浓度，但不可能选择。 （2）表达CD-8时，表达CD-8时使用金属。要将珠连接到细胞上，可以在视觉上区分表达细胞。当前，我们正在考虑一种用于表达CD-8和NCX1的方法。我们正在研究要表达的CD-8和NCX-1的cDNA量以及cDNA的比率时间。达到共表达后，我们将在细胞上传播金属珠，并考虑带有珠子表达NCX1的细胞的细胞作为指标，并计划测量NCX电流。

项目成果

Yasuhide Watanabe,Takahiro Iwamoto,Isao Matsuoka,Satoko Ohkubo,Tomoyuki Ono,Tomokazu Watano,Munekazu Shigekawa & Junko Kimura: "Inhibitory effect of 2,3-butanedione monoxime (BDM) on Na^+/Ca^<2+> exchange current in guinea-pig cardiac ventricular myocytes

渡边泰秀、岩本贵宏、松冈功、大久保佐子、小野智之、渡野智和、重川宗和