神経回路素子の活動を視覚化する手法の開発

开发一种可视化神经回路元件活动的方法

基本信息

批准号：
10780502
负责人：
森田光洋
金额：
$ 1.22万
依托单位：
Tokyo University of Pharmacy and Life Science
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1998
资助国家：
日本
起止时间：
1998 至 1999
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-10780502/
关键词：
遺伝子発現イメージング神経回路網レポータージーン

项目摘要

本研究は神経系における特定の細胞集団を蛍光標識し、それらの細胞集団が示す生理反応をそれ以外の細胞から差別化して測定する手法の開発を目的とした。具体的にはGFP(Green Fluorescence Protein)とその改変体を利用して遺伝子工学的に細胞内カルシウム、膜電位などの測定を行う技術を開発する(測定技術の開発)とともに、神経組織由来の初代培養細胞にこれらの遺伝子産物を細胞種特異的なプロモーター(遺伝子の転写調節領域)を利用して発現させて標識し、標識された細胞を差別化して測定を行う(標識技術の開発)ことを目指した。測定技術の開発としては、GFPと既存のカルシウム蛍光色素との間で見られる相互作用に着目して試験管内の検討を行った。その結果、GFPとfura-redもしくはBFP、CFP(blueまたはcyanの蛍光を発するGFPの改変体)とfura-redを共存させた状態においてカルシウム依存的なGFP由来の蛍光の変化が見られた。これはfura-redのカルシウム依存的な吸収スペクトルの変化がGFPの蛍光、もしくは励起光に影響を与えているためと考えられる。今後はこの現象を細胞内カルシウムの測定に応用するべく、株化細胞を用いた開発を進めていきたいと考えている。標識技術の開発としては、リポフェクション法の改良と、各種プロモーターの利用により、ラット大脳皮質由来初代培養細胞においてGFPの発現させ、神経細胞とアストロサイトをそれぞれ差別化して標識し、既存のカルシウム色素、CCDカメラのシステムを利用してカルシウムを測定することに成功した。この内容については第22回日本神経科学会において発表し、Neuroscience Research誌に掲載された。

这项研究的目的是开发一种荧光标记神经系统中特定细胞群的方法，并以将这些细胞群与其他细胞区分开来的方式测量这些细胞群的生理反应。具体来说，我们将开发一种利用GFP（绿色荧光蛋白）及其修饰形式的基因工程测量细胞内钙、膜电位等的技术（测量技术的开发），并且我们还将使用原代神经组织来源的我们的目标使用细胞类型特异性启动子（基因转录调控区）在培养细胞中表达和标记这些基因产物，并区分和测量标记的细胞（标记技术的开发）。为了开发测量技术，我们进行了体外研究，重点关注观察到的 GFP 和现有钙荧光染料之间的相互作用。结果，在GFP与fura-red或BFP共存、以及CFP(发出蓝色或青色荧光的修饰的GFP)与fura-red共存时，观察到了来自GFP的荧光的钙依赖性变化。这被认为是因为呋喃红的钙依赖性吸收光谱的变化影响了GFP的荧光或激发光。将来，我们希望使用已建立的细胞系进行开发，以便将这种现象应用于细胞内钙的测量。标记技术的开发包括改进脂转染方法，使用各种启动子在大鼠大脑皮层来源的原代培养细胞中表达GFP，分化和标记神经元和星形胶质细胞，并使用现有的钙染料，我们成功地使用CCD相机系统测量钙。该内容在日本神经科学学会第 22 届年会上发表，并发表在《神经科学研究》杂志上。