筋小胞体カルシウムポンプN末端領域の機能解析

肌浆网钙泵N端区域的功能分析

基本信息

批准号：
10780378
负责人：
山崎和生
金额：
$ 1.09万
依托单位：
Asahikawa Medical College
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1998
资助国家：
日本
起止时间：
1998 至 1999
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-10780378/
关键词：
筋小胞体カルシウムポンプ部位特異的変異プロテアソーム COS-1

项目摘要

筋小胞体カルシウムポンプのN末端領域の機能について調べるため、カルシウムポンプのN末端から9番目のアミノ酸までの間に置換や欠失変異を導入した変異体をCOS-1細胞で発現させた。ミクロソーム分画中のカルシウムポンプの発現量をウェスタンブロットにより定量したところ、欠失変異体の多くと置換変異体のうち4番目のアラニンをリジンかアスパラギン酸に変えたものおよび5番目のヒスチジンをリジンに変えたもので発現量が野生型と比較して著しく低下していた。次にCOS-1で発現させた変異体のカルシウム輸送活性を測定した。COS-1細胞中で野生型と同等の発現を示す変異体では野生型と同等の活性を持っていた。COS-1細胞中での発現の悪い変異体では、N末端から3番目から6番目のアミノ酸のうちどれか一つを欠失させた変異体は野生型と同等の活性を持っていたが、その他の変異体はカルシウム輸送活性を喪失していた。以上の結果は、筋小胞体カルシウムポンプのN末端領域には活性に直接関与している残基は存在しないが、ポンプの高次構造の安定化に必須であることを示唆している。COS-1細胞中での発現が悪い変異体でも、in vitro の発現系では野生型と変わらない発現が観察された。このことからCOS-1細胞中で発現の悪い変異体は、翻訳後COS-1内の何らかの系で分解されていることが予想された。発現したカルシウムポンプタンパクのCOS-1細胞中での分解の速度をPulse-Chase実験により測定すると、野生型では非常に遅いが、発現の悪い変異体では顕著に速くなっていることが示された。N末端から3番目Alaを欠失させた変異体の分解はプロテアソームの特異的阻害剤であるlactscystinによって強く抑制された。以上の結果より、N末端領域はカルシウムポンプの正しいfoldingまたは正しくfoldしたカルシウムポンプの安定性(あるいはこの両方)に重要であることを示している

为了研究肌质网钙泵的N末端区域的功能，在COS-1细胞中表达了钙泵的N末端和第九氨基酸之间引入取代和缺失突变的突变体。当微粒体馏分中钙泵的表达水平通过蛋白质印迹定量，在许多缺失突变体和取代突变体中，与野生型相比，表达水平显着降低，丙氨酸在第四和丙氨酸位于第五，而在第五则是组氨酸。接下来，测量了在COS-1中表达的突变体的钙转运活性。在COS-1细胞中表现出与野生型相似表达的突变体的活性与野生型相似。在COS-1细胞表达不良的突变体中，从N末端删除了第三到第六个氨基酸的突变体的活性与野生型相似，而其他突变体失去了钙转运活性。以上结果表明，尽管在肌浆网的N末端区域中不存在直接参与活性的残基，但它们对于稳定泵的高阶结构至关重要。观察到在COS-1细胞中表达较差的突变体在体外表达系统中的表达没有不同的表达。这表明在COS-1细胞中表达较差的突变体在翻译后COS-1的某些系统中已降解。通过脉冲练习实验确定COS-1细胞中表达钙泵蛋白的降解速率，表明它们在野生型中的速度非常慢，但在表达不足的突变体中明显更快。从N-末端删除第三个ALA的突变体的降解受到lactscystin的强烈抑制，这是蛋白酶体的特定抑制剂。以上结果表明，N末端区域对于钙泵的正确折叠或钙泵的稳定性（或两者）很重要。