耳下腺腺房細胞においてVAMP-2と相互作用するタンパク質の検索

寻找腮腺腺泡细胞中与 VAMP-2 相互作用的蛋白质

• 批准号: 09771550
• 负责人: 吉垣 純子
• 金额: $ 1.41万
• 依托单位: Nihon University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1997
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1997 至 1998
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-09771550/
• 关键词: 分泌; 唾液腺; cAMP; 開口放出; 分泌顆粒

本研究では,耳下腺腺房細胞におけるcAMP依存的なアミラーゼ分泌の分子機構の解明を目的として,SNAREタンパク質のひとつであるVAMP2の機能発現メカニズムについて解析を行った。そのために,VAMP2にたいする抗体anti-SER4256を作製し,免疫沈降によって腺房細胞内におけるVAMP2の状態を調べることにした。ラット耳下腺腺房細胞から分泌顆粒膜を単離し,可溶化後,免疫沈降を行った。すると,可溶化成分にVAMP2が含まれているにも関わらず,VAMP2の沈降は見られなかった。それに対して,可溶化分泌顆粒膜画分に細胞質画分およびcAMPを反応させた後,免疫沈降を行うと,VAMP2の沈降が確認された。この効果は,cAMP依存性プロテインキナーゼ(PKA)の特異的な阻害剤であるH89によって阻害された。また,cAMPのかわりに,PKAの触媒サブユニットを加えた場合にもVAMP2の沈降が見られ,PKAの活性化が,anti-SER4256によるVAMP2の免疫沈降に必要であることが示された。これらのことから,VAMP2は,刺激をしない状態では何らかのタンパク質と結合しており,それにより抗体がVAMP2と結合できない状態にあると考えられる。anti-SER4256によるVAMP2上の認識部位は,t-SNAREとの相互作用に必須であることが報告されており,PKAの活性化を介してこの部位が露出することによって,はじめてVAMP2とt-SNAREとの結合が可能になると予測される。また,PKAの触媒サブユニットだけではVAMP2の免疫沈降が起きず,細胞質が必要なことや,PKAによってリン酸化されることが必要なのは,細胞質画分であることが明らかになった。したがって,細胞質に存在する何らかのタンパク質のリン酸化を介して,VAMP2のt-SNARE結合部位の露出が引き起こされると考えられる。

在这项研究中，我们分析了VAMP2的功能表达的机理，VAMP2是一个蛋白质蛋白之一，目的是阐明腮腺腺泡细胞中CAMP依赖性淀粉酶分泌的分子机制。为此，我们决定通过免疫沉淀生成抗体抗Ser4256对VAMP2产生抗体4256，并研究VAMP2的状态。从大鼠腮腺细胞中分离出分泌的颗粒，并在溶解后进行免疫沉淀。因此，尽管溶解成分含有VAMP2，但仍未观察到VAMP2的沉淀。相比之下，在细胞质分数和cAMP与溶解的分泌颗粒馏分反应后，进行了免疫沉淀，并确认了VAMP2。 H89抑制了这种作用，H89是CAMP依赖性蛋白激酶（PKA）的特异性抑制剂。此外，当添加PKA的催化亚基代替CAMP时，还观察到VAMP2沉淀，表明PKA激活是通过抗Ser4256对VAMP2进行免疫沉淀需要的。从这些结果中可以相信，VAMP2在没有刺激的情况下与某些蛋白质结合，因此抗体无法与VAMP2结合。据报道，抗SER4256在VAMP2上的识别位点对于与T-SNARE的相互作用至关重要，并且可以预测，只有通过激活PKA，可以通过暴露于该站点的VAMP2与T-SNARE的结合。此外，已经揭示了PKA的催化亚基不会引起VAMP2的免疫沉淀，并且需要细胞质分数，并且必须通过PKA磷酸化。因此，人们认为，VAMP2的T-nare结合位点的暴露是通过细胞质中一些蛋白质的磷酸化引起的。

项目成果

Dohke,Y., Hara-Yokoyama,M. Fujita-Yoshigaki,J. et al.: "ADP-ribosylation factors in rat parotid acinar cells." European Journal of Morphology. 36. 186-189 (1998)

Dohke，Y.，原横山，M.

Sugiya,H., Michikawa,H., Mitsui,Y., Fujita-Yoshigaki,J. et al.: "Ca^<2+>-nitiric oxide-cGMP signaling in rabbit parotid acinar cells." European Journal of Morphology. 36. 194-197 (1998)

杉谷，H.，道川，H.，三井，Y.，藤田吉垣，J.

Fujita-Yoshigaki,J.: "Divergence and convergence in regulated exocytosis: The characteristics of cAMP-dependent enzyme secretion of parotid salivary acinar cells." Cellular Signaling. 10(6). 371-375 (1998)

Fujita-Yoshigaki, J.：“调节胞吐作用的发散和收敛：腮腺唾液腺泡细胞 cAMP 依赖性酶分泌的特征。”

Michikawa,H., Mitsui,Y., Fujita-Yoshigaki,J. et al.: "cGMP production is coupled to Ca^<2+>-dependent nitric oxide generation in rabbit parotid" Cell Calcium. 23(6). 405-412 (1998)

道川，H.，三井，Y.，藤田吉垣，J.

吉垣 純子: "Divergence and convergence in regulated exocytosis:The characteristics of cAMP-dependent enzyme secretion of parotid salivary acinar cells." Cellular Singnaling. 10(in press). (1998)

Junko Yoshigaki：“调节胞吐作用的分歧和收敛：腮腺唾液腺细胞的 cAMP 依赖性酶分泌特征。”细胞信号传导 10（出版中）。