骨芽細胞における新規石灰化関連チロシンホスファターゼ遺伝子の解明とクローニング

成骨细胞中新型矿化相关酪氨酸磷酸酶基因的阐明和克隆

基本信息

批准号：
09771528
负责人：
出山義昭
金额：
$ 1.47万
依托单位：
Hokkaido University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1997
资助国家：
日本
起止时间：
1997 至 1998
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-09771528/
关键词：
チロシンホスファターゼクローニング骨芽細胞石灰化

项目摘要

今年度は、骨芽細胞様MC3T3-El細胞をconfluence時ならびにconfluence後14日まで培養し細胞を回収してそのtotalRNAを抽出し、チロシンホスファターゼ遺伝子の発現の変化について検討を行った。○RT-PCR法によるチロシンホスファターゼ遺伝子の発現の解析チロシンホスファターゼ活性を示すコンセンサス配列からセンスならびにアンチセンスのプライマー数種類を設計し、培養各時期の骨芽細胞のtotalRNAから逆転写酵素を用いて合成したcDNAをPCRにより増幅した。その結果各時期におけるPCR産物が検出された。しかし、培養時期間の断片のサイズならびに発現量の違いは認められなかった。これらのPCR産物のうち現在のところクローニングされていないと考えられる産物についてその塩基配列について検討を行っている。!O培養各時期におけるチロシンホスファターゼ活性の変化の解析MC3T3-El細胞の分化過程においてチロシンホスファターゼ活性を有する数種類の酵素が粗精製された。これらの中には細胞の分化とともに活性が変動するものも認められ、チロシンホスファターゼが骨芽細胞の分化に関わっている可能性が示唆された。今後は生化学的ならびに分子生物学的手法の両方を用いたアプローチによりこれらの精製、さらにはクローニングを行い、チロシンホスファターゼが骨芽細胞の成長発達さらには石灰化とどのように関わっているかについて検索を行おうと考えている。

今年，在汇合处和汇合后14天培养了成骨细胞样的MC3T3-EL细胞，并收集了细胞，并提取了总RNA，并检查了酪氨酸磷酸酶基因的表达变化。 ○通过RT-PCR法对酪氨酸磷酸酶基因的表达进行分析，从显示酪氨酸磷酸酶活性的共识序列中设计了几种类型的感觉和反义引物，并使用来自成骨细胞的总RNA从培养期的培养期的总RNA合成CDNA，并通过PCR扩增。结果，检测到每个阶段的PCR产品。但是，没有观察到培养期之间片段的大小和表达水平的差异。在这些PCR产物中，正在研究目前尚未克隆的产品的核苷酸序列的基础序列。呢在MC3T3-EL细胞的分化过程中，在O培养的每个时期的酪氨酸磷酸酶活性变化分析几种类型的具有酪氨酸磷酸酶活性的酶。其中，活性随细胞分化而变化，表明酪氨酸磷酸酶可能与成骨细胞分化有关。将来，我们计划通过使用生化和分子生物学技术的方法纯化和克隆这些方法，并寻找酪氨酸磷酸酶如何参与成骨细胞生长和发育以及钙化。