6-ピルボイルテトラヒドロプテリン合成酵素(PTPS)の人工的破壊:脳内ビオプテリン欠損マウスの作成

人工破坏 6-丙酮酰四氢蝶呤合酶 (PTPS)：创建脑部生物蝶呤缺陷小鼠

基本信息

批准号：
09770105
负责人：
一瀬千穂
金额：
$ 1.22万
依托单位：
Fujita Health University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1997
资助国家：
日本
起止时间：
1997 至 1998
项目状态：
已结题

项目摘要

この研究の目的はチロシン水酸化酵素、トリプトファン水酸化酵素、およびフェニルアラニン水酸化酵素の補酵素であるビオプテリン(BH4)が神経の発生や機能の維持にどのような役割を果たしているのかを調べることである。BH4やその前駆物質は血液脳関門を通過しにくいと考えられるので、ジーンターゲッティングの手法でマウスの6-ピルボイルテトラヒドロプテリン合成酵素(PTPS)の遺伝子を破壊し(PTPS完全欠損マウス)、一方肝臓では肝特異的プロモーターを利用してPTPS活性を発現させれば、神経系でのみBH4の不足をきたす特異な病態マウス(脳内ビオプテリン欠損マウス)を作成できる。マウスPTPS遺伝子のエクソン1から4を含む10.2kbの遺伝子DNAのうち、プロモターと開始メチオニンをコードするエクソン1をpgk-ネオマイシン耐性遺伝子で置換し、5'側にMCI-ジフテリア毒素のAフラグメントの遺伝子を付加したターゲッティングベクターを作成した。このベクターを電気穿孔で129/SVJ由来のES細胞に導入しG418で選択した。150個の耐性クローンをサザンハイブリザイゼーション法により解析した結果3個の相同組換え体を得た。これらのES細胞をC57BL/6JマウスのBlasteystに注入してオス3匹、メス1匹のキメラマウスを作成した。キメラマウスから子孫マウスに導入した遺伝子の変異が伝達されるかどうかを確認するためキメラマウスとC57BL/6Jマウスの交配実験を行ったところ、PTPS遺伝子のアリールの一本が破壊された雌雄複数のへテロ接合体を得た。今後これらを交配してホモ接合体(PTPS完全欠損マウス)を作成し、その表現型を解析する予定である。PTPS完全欠損マウスはヒトの異型フェニルケトン尿症に相当し同様の症状を発症することが期待されるが、生仔が得られない場合は胎仔の解析を行う。

这项研究的目的是研究酪氨酸羟化酶，色氨酸羟化酶和苯丙氨酸羟化酶辅酶生物蛋白（BH4）的作用，该辅酶在神经元发育和维持功能中起着作用。由于BH4及其前体被认为难以越过血脑屏障，因此，如果基因靶向方法破坏了6-吡喃富烯曲霉蛋白螺旋蛋白合酶（PTPS）基因（完全PTPS）基因（完全PTPS缺乏型小鼠）在基因靶向技术中使用肝脏的独特（PTPS）在肝脏中引起的（在肝脏中引起的），则在肝脏中引起了独特的（在肝脏中）。神经系统中的BH4缺乏。在含有外显子1至4的10.2 kb基因DNA中，在编码启动子和启动蛋氨酸的外显子1中被PGK-纽霉素抗性基因代替，并创建了一个靶向载体，在该基因中添加了MCI-二脂蛋白的A片段的基因，将其添加到5'侧中。该载体被电穿孔到129/SVJ衍生的ES细胞中，并选择用于G418。通过南部杂交分析了150个抗性克隆，并获得了三种同源重组。将这些ES细胞注射到BlastEyst C57BL/6J小鼠中，以产生3名雄性和1个雌性嵌合小鼠。为了检查从嵌合小鼠引入的基因中的突变是否传播到后代小鼠，我们在嵌合小鼠和C57BL/6J小鼠之间进行了交配实验，并获得了雄性和女性的多个杂合子，其中一种PTPS基因的芳基被破坏了。这些将跨越以创建纯合（PTPS完全不足的小鼠），并将分析其表型。完全缺乏PTP的小鼠对应于人类非典型苯酮尿症，并有望产生相似的症状，但是如果未获得婴儿，则进行胎儿分析。