6-ピルボイルテトラヒドロプテリン合成酵素(PTPS)の人工的破壊:脳内ビオプテリン欠損マウスの作成

人工破坏 6-丙酮酰四氢蝶呤合酶 (PTPS)：创建脑部生物蝶呤缺陷小鼠

基本信息

批准号：
09770105
负责人：
一瀬千穂
金额：
$ 1.22万
依托单位：
Fujita Health University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1997
资助国家：
日本
起止时间：
1997 至 1998
项目状态：
已结题

项目摘要

この研究の目的はチロシン水酸化酵素、トリプトファン水酸化酵素、およびフェニルアラニン水酸化酵素の補酵素であるビオプテリン(BH4)が神経の発生や機能の維持にどのような役割を果たしているのかを調べることである。BH4やその前駆物質は血液脳関門を通過しにくいと考えられるので、ジーンターゲッティングの手法でマウスの6-ピルボイルテトラヒドロプテリン合成酵素(PTPS)の遺伝子を破壊し(PTPS完全欠損マウス)、一方肝臓では肝特異的プロモーターを利用してPTPS活性を発現させれば、神経系でのみBH4の不足をきたす特異な病態マウス(脳内ビオプテリン欠損マウス)を作成できる。マウスPTPS遺伝子のエクソン1から4を含む10.2kbの遺伝子DNAのうち、プロモターと開始メチオニンをコードするエクソン1をpgk-ネオマイシン耐性遺伝子で置換し、5'側にMCI-ジフテリア毒素のAフラグメントの遺伝子を付加したターゲッティングベクターを作成した。このベクターを電気穿孔で129/SVJ由来のES細胞に導入しG418で選択した。150個の耐性クローンをサザンハイブリザイゼーション法により解析した結果3個の相同組換え体を得た。これらのES細胞をC57BL/6JマウスのBlasteystに注入してオス3匹、メス1匹のキメラマウスを作成した。キメラマウスから子孫マウスに導入した遺伝子の変異が伝達されるかどうかを確認するためキメラマウスとC57BL/6Jマウスの交配実験を行ったところ、PTPS遺伝子のアリールの一本が破壊された雌雄複数のへテロ接合体を得た。今後これらを交配してホモ接合体(PTPS完全欠損マウス)を作成し、その表現型を解析する予定である。PTPS完全欠損マウスはヒトの異型フェニルケトン尿症に相当し同様の症状を発症することが期待されるが、生仔が得られない場合は胎仔の解析を行う。

本研究的目的是探讨生物蝶呤 (BH4)（酪氨酸羟化酶、色氨酸羟化酶和苯丙氨酸羟化酶的辅酶）在维持神经发育和功能中的作用。由于BH4及其前体被认为难以通过血脑屏障，因此我们使用基因打靶方法破坏小鼠（PTPS完全缺陷小鼠）的6-丙酮酰四氢蝶呤合酶（PTPS）基因，而肝脏现在，通过使用肝脏特异性启动子表达 PTPS 活性，可以培育出具有独特病理状况的小鼠（脑生物蝶呤缺陷小鼠），其中 BH4 仅在神经系统中缺陷。在含有小鼠PTPS基因的外显子1至4的10.2kb基因DNA中，编码启动子和起始甲硫氨酸的外显子1被替换为pgk-新霉素抗性基因，并且5'侧被替换为MCI-白喉毒素A片段添加该基因后创建了靶向载体。通过电穿孔将该载体导入129/SVJ来源的ES细胞中并用G418进行选择。通过Southern杂交分析150个抗性克隆，结果获得了三个同源重组体。这些 ES 细胞被注射到 C57BL/6J 小鼠的 Blasteyst 中，以产生三雄一雌的嵌合小鼠。为了证实从嵌合小鼠引入的基因突变是否遗传给子代小鼠，我们对嵌合小鼠和C57BL/6J小鼠进行了杂交实验，发现多只雄性和雌性小鼠都带有PTPS的一个等位基因。获得了杂合子。未来，我们计划将这些小鼠杂交以产生纯合子（PTPS完全缺陷的小鼠）并分析它们的表型。完全缺乏 PTPS 的小鼠对应于人类的非典型苯丙酮尿症，预计会出现类似的症状，但如果无法获得活的后代，将对胎儿进行分析。